DB34_T 4268-2022 发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定.docx
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1、ICS67.140CCSX5534安徽省地方标准DB34/T42682022发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定DeterminationofaflatoxinBandGgroupsinfermentedtea2022-08-31发布2022-09-30实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T42682022前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位:安徽农业大学、安徽省茶业集团有限公司、肥西县
2、农业综合服务中心、云南微生物研究所。本文件主要起草人:周育、管道健、张海柱、唐蜀昆、张梁、王希春。IDB34/T42682022发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定1范围2本文件规定了发酵茶中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G(以下简称AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)的测定方法。本文件第一法为双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法,适用于发酵茶中黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。本文件第二法为双柱净化-液相色谱柱串联质谱法,适用于发酵茶中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引
3、用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB5009.22食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4第一法双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法原理试样中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取,提取液经多功能净化柱和免疫亲和柱净化和富集,净化液经浓缩、定容和过滤后,经液相色谱分离,柱后光化学法衍生,荧光检测器检测。外标法定量。试剂及材料除非另有说明,本方法
4、所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。4.2.1试剂4.2.1.1甲醇(CH3OH,CAS:67-56-1):色谱纯。4.2.1.2乙腈(CH3CN,CAS:75-05-8):色谱纯。4.2.1.3氯化钠(NaCl,CAS:7647-14-5)。4.2.1.4磷酸氢二钠(Na2HPO4,CAS:7558-79-4)。4.2.1.5磷酸二氢钾(KH2PO4,CAS:7778-77-0)。4.2.1.6氯化钾(KCl,CAS:7447-40-7)。4.2.1.7盐酸(HCl,CAS:7647-01-0)。1DB34/T426820224.2.1.8吐温-20(C58H114O26,
5、CAS:9005-64-5)。4.2.1.9硫酸镁(MgSO4,CAS:7487-88-9)。4.2.1.10聚乙烯基吡络烷酮(PVP,CAS:9003-39-8)。4.2.1.11N-丙基乙二胺(PSA,CAS:111-39-7)。4.2.2材料4.2.2.1移液管:1mL和5mL规格。4.2.2.2针筒式滤器:100mL规格,可连接于空气压力泵或手动加压。4.2.2.3玻璃纤维滤纸:快速、高载量、液体中颗粒保留1.6m。4.2.2.4真菌毒素多功能净化柱(以下简称多功能净化柱)。4.2.2.5免疫亲和柱:AFB1柱容量200ng,AFB1柱回收率80%,AFG2的交叉反应率80%。4.2.
6、2.6一次性针式过滤器:带0.22m有机相微孔滤膜。4.2.3试剂配制4.2.3.1乙腈-水溶液(84+16):取840mL乙腈加入160mL水,混匀。4.2.3.2甲醇-水溶液(70+30):取700mL甲醇加入300mL水,混匀。4.2.3.3磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS):称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾,用900mL水溶解,用盐酸调节pH至7.4,用去离子水定容至1000mL。4.2.3.4含1%吐温-20的PBS:取10mL吐温-20,用PBS定容至1000mL。4.2.4标准品4.2.4.1AFB1标准品(C17H12O6,CAS
7、:1162-65-8):纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.2AFB2标准品(C17H14O6,CAS:7220-81-7):纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.3AFG1标准品(C17H12O7,CAS:1165-39-5):纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.4AFG2标准品(C17H14O7,CAS:7241-98-7):纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.5标准溶液配制4.2.5.1标准储备溶液分别称取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2各1mg(精确至0.01mg),
8、用乙腈溶解并定容至100mL。各溶液浓度为10g/mL,溶液转移至试剂瓶中后,在-20下避光保存、备用,有效期三个月。临用前,参照GB5009.22进行浓度校准。4.2.5.2混合标准工作液(AFB1和AFG1:各100g/L,AFB2和AFG2:各25g/L)移液管准确移取AFB1和AFG1标准储备溶液各1mL,AFB2和AFG2标准储备溶液各250L至100mL容量瓶中,乙腈定容。密封后避光-20下保存,一个月内有效。4.2.5.3标准系列工作溶液稀释2DB34/T42682022准确移取混合标准工作液,按照样品检测需求,以乙腈为溶剂作适度的梯度稀释,以符合分析检测要求。仪器和设备4.3.
9、1高速粉碎机。4.3.2涡旋振荡器或摇床。4.3.3天平:感量0.01g和0.00001g。4.3.4涡旋混合器。4.3.5离心机:转速6000g。4.3.6固相萃取装置:配15mL-50mL免疫亲和层析针筒。4.3.7空气压力泵。4.3.8氮吹仪。4.3.9液相色谱仪:配荧光检测器。4.3.10液相色谱柱。4.3.11黄曲霉毒素光化学柱后衍生器。4.3.12筛网:1mm2mm试验筛孔径。分析步骤4.4.1取样4.4.1.1茶汤采样量需大于1L,将所有液体样品在一个容器中混匀后,取其中任意的100mL样品,供检测用。4.4.1.2干茶采样量需大于1.0kg,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径
10、小于2mm,混合均匀后,以四分法缩分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。4.4.2提取4.4.2.1茶汤取50mL试样(精确至0.01mL),然后加入50mL乙腈(精确至0.01mL),7.5g氯化钠(精确至0.01g),涡旋1min,6000g离心10min,取上清液,再加入50mL乙腈重复提取,然后合并两次上清液,并加入2g氯化钠(精确至0.01g),2g硫酸镁(精确至0.01g),5gPVP(精确至0.01g),2gPSA(精确至0.01g),6000g离心10min,上清液用玻璃纤维滤纸过滤,收取虑液备用。4.4.2.2干茶称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中
11、,加入25mL乙腈-水溶液(4.2.3.1)或甲醇-水溶液(4.2.3.2),涡旋混匀,置于涡旋振荡器或摇床中振荡20min,将茶叶及取提液全部转移至针筒式滤器,真空抽滤(或手动加压过滤)。收集全部提取液于离心管中,在6000g下离心10min,上清液用玻璃纤维滤纸过滤,收取虑液备用。4.4.3净化3DB34/T426820224.4.3.1多功能净化柱净化移取适量上清液,按多功能净化柱的操作说明进行净化,收集全部净化液,并确保净化液多于4mL。4.4.3.2免疫亲和柱净化4.4.3.2.1上样液的准备用刻度移液管准确吸取上步的净化液4mL(茶汤样品20mL或依据浓度适当调整),加入46mL含
12、1%吐温-20的PBS(使用甲醇-水溶液作为黄曲霉毒素提取溶剂时,加入含1%吐温-20的PBS可减半加入),混匀。4.4.3.2.2免疫亲和柱准备将26条件下保存的免疫亲和柱从冷藏条件下取出,恢复至室温连接于固相萃取装置。4.4.3.2.3亲和层析净化待免疫亲和柱内原有液体流尽后,将上述样液(4.4.3.2.1)移至50mL注射器筒中(或按照批次分批次移入10mL-20mL注射器筒),调节下滴速度,控制样液以每秒一滴的速度稳定流过免疫亲和柱。样液流完后,向注射器筒内加入10mL含1%吐温-20的PBS,以每秒2滴的流速淋洗免疫亲和柱,并重复一次净化步骤。待清洗液流完后,用空气压力泵吹干免疫亲和
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