【课件】基因工程的基本操作程序 2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx
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1、第二节第二节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序苏云金杆菌苏云金杆菌与载体拼接与载体拼接 普通棉花普通棉花(无抗虫特性)(无抗虫特性)棉花细胞棉花细胞抗虫棉抗虫棉提取提取表达表达BtBt基因基因导入导入BtBt基因基因重组重组DNA分子分子培育转基因抗虫棉的简要过程培育转基因抗虫棉的简要过程问题探讨1.1.目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取2.2.基因表达载基因表达载体的构建体的构建目的基因目的基因受体细胞受体细胞3.3.将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞4.4.目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定第一步:目的基因的第一步:目的基因的筛选与与获取取什么是基因什么是
2、基因?基因通常是有基因通常是有遗传效效应的的DNA片段片段基因定基因定义:基因片段基因片段非基因片段非基因片段u原核生物的基因结构原核生物的基因结构非非编码区区非非编码区区编码区区编码区上游:区上游:启启动子子编码蛋白蛋白质,连续不不间断断编码区下游:区下游:终止子止子u真核生物的基因结构真核生物的基因结构非非编码区区编码区区非非编码区区外外显子:子:编码蛋白蛋白质内含子:不内含子:不编码蛋白蛋白质初初级转录产物物成熟成熟mRNA剪接剪接mRNA逆逆转录cDNA无剪接无剪接过程程第一步:目的基因的第一步:目的基因的筛选与与获取取一、目的基因一、目的基因(1)概念:用于改变受体细胞性状或获得预期
3、表达产物等的基因;与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。(基因。(Bt抗虫蛋白基因抗虫蛋白基因)。)。主要是主要是编码特定蛋白质编码特定蛋白质的基因的基因(2)实例:如何如何筛选目的基因目的基因?用苏云金杆菌制成的用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂生物杀虫剂,广泛用于防治,广泛用于防治棉花虫害已有多年历史棉花虫害已有多年历史苏云金杆菌苏云金杆菌的杀虫作用的杀虫作用与与Bt基因基因有有关关掌握了掌握了Bt基因的序列信息基因的序列信息对对Bt基因的表达产物基因的表达产物-对对Bt抗虫蛋白抗虫蛋白有了较为深入的了解有了较为深入的了解Bt基
4、因基因是培育转是培育转基因抗虫棉较为基因抗虫棉较为合适的目的基因合适的目的基因二、二、筛选合适的目的基因合适的目的基因第一步:目的基因的第一步:目的基因的筛选与与获取取l方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。二、二、筛选合适的目的基因合适的目的基因DNADNA测序仪测序仪核苷酸序列比对核苷酸序列比对氨基酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心美国国家生物信息中心第一步:目的基因的第一步:目的基因的筛选与与获取取 随着随着测序技术测序技术的发展,以及序列数据库(如的发展,以及序列数据库(如GenBankGenBank)、序列)、序列比比对工具(如对工具(如BLASTBLAST)等的应
5、用,)等的应用,越来越多的基因的结构和功能为人们所知越来越多的基因的结构和功能为人们所知,为科学家找到合适的,为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。目的基因提供更多机会和可能。目的基因如何目的基因如何获取取?第一步:目的基因的第一步:目的基因的筛选与与获取取三、目的基因的三、目的基因的获取取u方法:1.人工合成2.PCR获取和扩增目的基因3.构建基因文库(p82)基因组文库cDNA文库基因文库基因文库:把某种生物基因DNA通过酶切获得大量DNA片段,然后将这些片段与载体连接,再转入受体菌中,这样整个菌群克隆就包含该生物的全部基因片段,称为基因文库。PCR技术第一步:目的基因的第一步:目
6、的基因的筛选与与获取取 聚合酶链式反应聚合酶链式反应,根据根据DNADNA半保留复制半保留复制的原理的原理,在,在体外(体外(PCRPCR扩增仪扩增仪)提供参与提供参与DNADNA复制的复制的各种组分各种组分与与反应条件反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制大量复制的的技术。技术。u概念概念:体外模拟DNA复制,实现快速扩增DNAPCRPCR扩增仪扩增仪第一步:目的基因的第一步:目的基因的筛选与与获取取uDNA复制所需的基本条件:复制所需的基本条件:参与参与组分分在在DNA复制中的作用复制中的作用解旋解旋酶(体外用高温代替)(体外用高温代替)DNA母母链4种脱
7、氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合聚合酶引物引物提供提供DNA复制的复制的模板模板打开打开DNA双双链使使DNA聚合聚合酶能能够从引物的从引物的3端端开始开始连接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸合成合成DNA子子链的的原料原料催化合成催化合成DNA子子链DNA聚合聚合酶不能直接不能直接发起子起子链的的合成,只能催化合成,只能催化单个核苷酸加到个核苷酸加到3端而延伸子端而延伸子链什么是引物?什么是引物?第一步:目的基因的第一步:目的基因的筛选与与获取取uPCR反反应体系中有哪些必需的物体系中有哪些必需的物质:DNA模板模板2种种引物引物原料:原料:耐高温耐高温的的DNA聚合聚合酶Mg+:激活激活DNA聚合聚合
8、酶有两条模板有两条模板链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸uPCR扩增的增的过程程:1.目的基因目的基因DNA受受热变性性后解后解为单链(解旋)(解旋)变性性2.引物与引物与单链相相应互互补序列序列结合合3.以以单链DNA为模板,在模板,在DNA聚合聚合酶的作用下的作用下延伸延伸,即将四种脱氧,即将四种脱氧核苷酸加到引物的核苷酸加到引物的3端端。复性复性延伸延伸uPCR反反应过程示意程示意图:第一轮循环:(每次循环分为第一轮循环:(每次循环分为变性变性、复性、和延伸三步。)、复性、和延伸三步。)变性:解旋变性:解旋uPCR反反应过程示意程示意图:第一轮循环:(每次循环分为变性、第一轮循环:(每次循环
9、分为变性、复性复性、和延伸三步。)、和延伸三步。)复性的复性的过程只有程只有引物与引物与DNA模板模板链结合合吗?不不一一定定,也也存存在在解解开开的的两两条条DNA单单链链的的结结合合,原原因因:引引物物较较短短,更更容容易易结结合合;引引物物量量多多,引引物物与与模模板板的的碰撞结合机会更高。碰撞结合机会更高。引物结合概率更高。引物结合概率更高。uPCR反反应过程示意程示意图:第一轮循环:(每次循环分为变性、复性、和第一轮循环:(每次循环分为变性、复性、和延伸延伸三步。)三步。)子链延伸方向从子链延伸方向从5端到端到3端端第一第一轮循循环的的产物作物作为第二第二轮反反应的模板,的模板,经过
10、变性、复性和延伸性、复性和延伸三步三步产生第二生第二轮循循环的的产物。物。第二第二轮循循环的的产物作物作为第第三三轮反反应的模板,的模板,经过变性、复性和延伸性、复性和延伸三步三步产生生第三第三轮循循环的的产物。物。第二轮循环第二轮循环第第三三轮轮循循环环指数形式扩增:指数形式扩增:2n(n代表扩增循环代表扩增循环的次数)的次数)uPCR反反应过程示意程示意图:uPCR扩增形式增形式:PCR反应过程都在反应过程都在PCR扩增仪扩增仪中自动完成。中自动完成。uPCR反反应过程程:变性、复性和延伸性、复性和延伸常采用常采用琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳来鉴定来鉴定PCR的产物。的产物。如何判断如何判
11、断PCR扩增增是否成功?是否成功?一次成功的一次成功的PCR扩增应扩增应产生与预期大小一致的产生与预期大小一致的DNA片段片段。Marker旁栏思考旁栏思考用用PCR可以扩增可以扩增mRNA吗?吗?不能,不能,RNA不稳定,不能直接作为模板不稳定,不能直接作为模板,需要将,需要将mRNA逆转录为逆转录为cDNA(RT-PCR),然后再进行扩增。然后再进行扩增。mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链DNA链链mRNA链链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶cDNA 一一般般不不可可以以,游游离离的的DNA片片段段容容易易被被分分解解,并并且且无无法法进进行行复复制,更不能遗传给下一代
12、制,更不能遗传给下一代。获得目的基因之后可以直接得目的基因之后可以直接导入受体入受体细胞胞吗?第二步:基因表达第二步:基因表达载体的构建体的构建(核心)(核心)一、基因表达一、基因表达载体的目的体的目的(1 1)使目的基因在受体细胞中)使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在,且,且可以遗传可以遗传给下一代;给下一代;(2 2)使目的基因能够使目的基因能够在受体细胞中在受体细胞中表达和发挥作用表达和发挥作用。二、基因表达二、基因表达载体的体的组成成位置:位置:功能:功能:RNA聚合酶聚合酶识别和结合识别和结合的部位,的部位,驱动基因转录驱动基因转录基因的上游基因的上游(一段有特殊(一段有特殊结构
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