【南昌大学食品学院】优质课《食品微生物学》 第十四章食品中微生物检验技术.ppt
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1、【南昌大学食品学院】优质课全国特级教师 江新欢 博士教授食品微生物学食品微生物学第第十四十四章章 食品中微生物检验技术食品中微生物检验技术食食 品品 微微 生生 物物 检检 验验 的的 范范 围围 食品的检验食品的检验生产环境的检验生产环境的检验车间用水车间用水空气空气地面地面墙壁墙壁原辅料检验原辅料检验食用动物、果蔬食用动物、果蔬谷物谷物添加剂添加剂食品加工、储藏、食品加工、储藏、销售诸环节的检验销售诸环节的检验食品从业人员的卫生状况食品从业人员的卫生状况加工工具加工工具运输车辆运输车辆包装材料包装材料出厂食品出厂食品可疑食品可疑食品食物中毒食品的检验食物中毒食品的检验第一节第一节 食品微生
2、物检验的范围食品微生物检验的范围生生产产环环境境的的检检验验原辅料的检验原辅料的检验食品加工、储藏、销售储环节的检验食品加工、储藏、销售储环节的检验成品食品的检验成品食品的检验第二节第二节 食品微生物检验的指标食品微生物检验的指标我国卫生部颁布的食品微生物指标我国卫生部颁布的食品微生物指标有有菌落总数、大肠菌群和致病菌。菌落总数、大肠菌群和致病菌。1、菌落总数菌落总数是指食品检样经过处理,是指食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间)培培养温度和培养时间)培养后,所得养后,所得每每g(mL)检检样中形成的微生物菌落总样中形成的微生物菌落总数。数。1、
3、菌落总数定义:指食品检样经过处理,在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。意义意义:是判断食品卫生质量的重要依据之一:是判断食品卫生质量的重要依据之一。(1)可以反应食品的新鲜度。)可以反应食品的新鲜度。(2)可以反应食品被细菌污染的程度。)可以反应食品被细菌污染的程度。(3)生产过程中食品是否变质。)生产过程中食品是否变质。(4)食品生产的一般卫生状况等。)食品生产的一般卫生状况等。2大肠菌群大肠菌群包括包括大肠杆菌和产气杆菌大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。的一些中间类型的细菌。这些细菌是寄居于人及温这些细菌是寄居于人及温血动物肠道内的常居菌,血动物肠道内的常居菌
4、,它随着大便排出体外。食它随着大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多,品中如果大肠菌群数越多,说明食品受粪便污染的程说明食品受粪便污染的程度越大。度越大。意义意义:以大肠菌群作为粪便污染食品的卫以大肠菌群作为粪便污染食品的卫生指标来评价食品的质量,具有广泛的意生指标来评价食品的质量,具有广泛的意义。义。3致病菌致病菌致病菌即能够引起人们发病的细菌。致病菌即能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合,应选择一定的参考菌对不同的食品和不同的场合,应选择一定的参考菌群进行检验。例如:海产品以群进行检验。例如:海产品以副溶血性弧菌副溶血性弧菌作为参作为参考菌群,蛋与蛋制品以考菌群,蛋与蛋制品以沙
5、门氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌变形杆菌等作为参考菌群,米、面类食品以等作为参考菌群,米、面类食品以蜡样芽蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、霉菌胞杆菌、变形杆菌、霉菌等作为参考菌群,罐头食等作为参考菌群,罐头食品以品以耐热性芽胞菌耐热性芽胞菌作为参考菌群等等。作为参考菌群等等。4霉菌及其毒素霉菌及其毒素有很多霉菌能够产生毒素,引起疾病,故应有很多霉菌能够产生毒素,引起疾病,故应该对产毒霉菌进行检验。该对产毒霉菌进行检验。例如:曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等,青霉例如:曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等,青霉属的桔青霉、岛青霉等,镰刀霉属的串珠镰属的桔青霉、岛青霉等,镰刀霉属的串珠镰刀霉、禾
6、谷镰刀霉等。刀霉、禾谷镰刀霉等。第三节第三节 微生物检验实验室微生物检验实验室实验室实验室微微生生物物检检验验室室无菌室无菌室无菌室无菌室缓冲间缓冲间(一)微生物检验室基本条件(一)微生物检验室基本条件总要求:总要求:对各室的共同要求是对各室的共同要求是高度的清洁卫生高度的清洁卫生,也就是要也就是要尽可能地创造无菌条件尽可能地创造无菌条件。基本条件:基本条件:微生物检验实验室微生物检验实验室必须具备显微镜工作必须具备显微镜工作,微微生物分离培养工作生物分离培养工作及及基本化学工作基本化学工作顺利进行顺利进行的基本条件。的基本条件。具体要求:具体要求:1、光线明亮,但避免阳光直射室内;、光线明亮
7、,但避免阳光直射室内;2、洁净无菌,地面与四壁平滑,便于清洁和消毒;、洁净无菌,地面与四壁平滑,便于清洁和消毒;3、空气清新,应有防风、防尘设备;、空气清新,应有防风、防尘设备;4、要有安全,适宜的电源和充足的水源;、要有安全,适宜的电源和充足的水源;5、具备整洁、稳固、适用的实验台,台面最好有耐、具备整洁、稳固、适用的实验台,台面最好有耐酸碱、耐腐蚀的黑胶板;酸碱、耐腐蚀的黑胶板;6、显微镜及实验室常用的工具、药品应设有存放橱、显微镜及实验室常用的工具、药品应设有存放橱柜。柜。无菌室结构与灭菌无菌室结构与灭菌(一)无菌室的结构与要求(一)无菌室的结构与要求1、无菌室的结构、无菌室的结构结构:
8、无菌室通常包括缓冲间和工作室两大部分。结构:无菌室通常包括缓冲间和工作室两大部分。大小:为了便于无菌处理,无菌室的面积和容积不大小:为了便于无菌处理,无菌室的面积和容积不宜过大,以适宜操作为准,一般可以为宜过大,以适宜操作为准,一般可以为912m2;无菌室的大小,应按照每个操作人员占用面积不少无菌室的大小,应按照每个操作人员占用面积不少于于3m2设置。缓冲间与工作间二者的比例可为设置。缓冲间与工作间二者的比例可为12,高度,高度2.5m左右。左右。配置:工作间内设固定的工作台、紫外灯、空气过配置:工作间内设固定的工作台、紫外灯、空气过虑装置和通风装置;较为理想的应有空调设备、空虑装置和通风装置
9、;较为理想的应有空调设备、空气净化装置,以便在进行微生物操作时切实达到无气净化装置,以便在进行微生物操作时切实达到无尘无菌。尘无菌。注意:工作间的内门与缓冲间的门力求迂回,避免注意:工作间的内门与缓冲间的门力求迂回,避免直接相通,减少无菌室内空气流动,以便保持工作直接相通,减少无菌室内空气流动,以便保持工作间的无菌条件。窗户应装有两层玻璃,以防外界微间的无菌条件。窗户应装有两层玻璃,以防外界微生物进入。生物进入。检验室建室建设布局布局图 1.1.办公台办公台 2.2.文件柜文件柜 3.3.样品柜样品柜 4.4.通风橱通风橱 5.5.实验边台实验边台 6 6,7.7.无菌台无菌台 8.8.天平台
10、天平台9.9.在落地仪器区再加个高温仪器台,放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等在落地仪器区再加个高温仪器台,放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等2、无菌室的要求、无菌室的要求内墙壁光滑,应尽量避免死角,以便于刷洗消毒;内墙壁光滑,应尽量避免死角,以便于刷洗消毒;应保持密封、防尘、清洁、干燥。进行操作时,应应保持密封、防尘、清洁、干燥。进行操作时,应尽量避免走动;尽量避免走动;室内设备简单,禁止放置杂物;室内设备简单,禁止放置杂物;工作台、地面和墙壁可用新洁尔灭或过氧乙酸溶液工作台、地面和墙壁可用新洁尔灭或过氧乙酸溶液擦洗消毒。擦洗消毒。使用前准备:使用前准备:杀菌前做好一切准备工作,然后
11、用杀菌前做好一切准备工作,然后用紫外线杀菌灯紫外线杀菌灯进进行空气消毒,开灯行空气消毒,开灯照射照射30min后关灯,后关灯,间隔间隔30min后方可进入室内工作。后方可进入室内工作。微生物微生物实验室主要室主要设备和器具和器具无菌室(接种室)或接种箱无菌室(接种室)或接种箱 恒温箱恒温箱电烘箱(干燥箱)烘箱(干燥箱)冰箱冰箱高高压蒸汽蒸汽灭菌菌锅离心机离心机接种接种针天平天平酒精灯酒精灯显微微镜常用玻璃器皿常用玻璃器皿均均质器、器、试管管夹,吸管,移液,吸管,移液枪,脱脂棉,牛皮,脱脂棉,牛皮纸,棉,棉绳,纱布,剪刀布,剪刀第四节第四节 培养基与试剂的基本要求培养基与试剂的基本要求1.培养基
12、的种培养基的种类按照功能来分按照功能来分 基本培养基基本培养基常用的有牛肉浸液、牛肉消化常用的有牛肉浸液、牛肉消化汤、普通普通营养养琼脂、蛋白脂、蛋白胨水等。水等。仅能满足微生物野生型菌株生仅能满足微生物野生型菌株生长需要的长需要的培养基培养基 选择性培养基性培养基根据某种微生物的特殊根据某种微生物的特殊营养要求或其养要求或其对某化学、物某化学、物理因素的抗性而理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌的培养基。其功能是使混合菌样中的劣中的劣势菌菌变成成优势菌,从而提高菌,从而提高该菌的菌的筛选效效率。率。如培养如培养肠道致病菌的道致病菌的SS培养基,含有胆酸培养基,含有胆酸盐,能抑,能抑制
13、革制革兰氏阳性菌,氏阳性菌,还含有含有柠檬酸檬酸钠和煌和煌绿,能抑制,能抑制大大肠杆菌,杆菌,这样就使致病菌沙就使致病菌沙门氏菌和志氏菌和志贺氏菌容氏菌容易生易生长。培养基中加入某些抗生素,也可起到。培养基中加入某些抗生素,也可起到选择性作用。性作用。鉴定培养基定培养基在无糖的基在无糖的基础培养基(蛋白培养基(蛋白胨水)中加入乳糖和指示水)中加入乳糖和指示剂,接,接种后培养,若微生物能种后培养,若微生物能发酵乳糖酵乳糖产酸,酸,则指示指示剂变色;若不色;若不发酵乳糖,酵乳糖,则颜色不色不变。常用的糖。常用的糖发酵管、硫化酵管、硫化氢培养基等培养基等都是都是鉴定培养基。半固体培养基也是定培养基。
14、半固体培养基也是鉴定培养基,因定培养基,因为它可它可以用来做穿刺以用来做穿刺试验,从而,从而鉴别微生物是否运微生物是否运动,以确定其是,以确定其是否有鞭毛。否有鞭毛。一些一些鉴别培养基培养基培养基名称培养基名称 加入化学物加入化学物质质 微生物微生物 代谢代谢产物产物 培养基特征性培养基特征性变化变化 主要用途主要用途 酪素培养基酪素培养基明胶培养基明胶培养基油脂培养基油脂培养基淀粉培养基淀粉培养基酪素酪素明胶明胶食用油、食用油、吐温吐温中性红指中性红指示剂示剂胞外蛋白酶胞外蛋白酶胞外蛋白酶胞外蛋白酶胞外脂肪酶胞外脂肪酶胞外淀粉酶胞外淀粉酶蛋白水解圈蛋白水解圈明胶液化明胶液化由淡红色变由淡红色
15、变成深红色成深红色淀粉水解圈淀粉水解圈鉴别产蛋白鉴别产蛋白酶菌株酶菌株鉴别产蛋白鉴别产蛋白酶菌株酶菌株鉴别产脂肪鉴别产脂肪酶菌株酶菌株鉴别产淀粉鉴别产淀粉酶菌株酶菌株 特殊培养基特殊培养基许多微生物在一般培养基上不能生多微生物在一般培养基上不能生长或生或生长不良,往往是由不良,往往是由于它于它们的的营养要求特殊。如果在基养要求特殊。如果在基础培养基中加入其他的培养基中加入其他的营养物养物质,如血液、血清、酵母浸膏、生,如血液、血清、酵母浸膏、生长因子等,那么可供因子等,那么可供营养要求养要求较高或有特殊高或有特殊营养要求的微生物在其中生养要求的微生物在其中生长。例如。例如溶血性溶血性链球菌,在
16、含有血液的培养基中,才能生球菌,在含有血液的培养基中,才能生长良好。良好。按对培养基按对培养基成分成分分类分类 天然培养基天然培养基是一类利用是一类利用动、植物或微生物体包括用其提取动、植物或微生物体包括用其提取物物制成的培养基,这是一类营养成分既复杂又丰富、制成的培养基,这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其难以说出其确切化学组成确切化学组成的培养基。的培养基。常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡萝
17、卜汁、椰子汁等,嗜粪微生毛浸汁、胡萝卜汁、椰子汁等,嗜粪微生(coprophilous microorganisms)可以利用粪水作为营养物质。天然培养基成本可以利用粪水作为营养物质。天然培养基成本较低,除在实验室经常使用外,也适于用来进行工业上大规模的较低,除在实验室经常使用外,也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。微生物发酵生产。合成(组合)培养基合成(组合)培养基是一类按微生物的营养要求精确是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种设计后用多种高纯化学试剂高纯化学试剂配制成的培养基。该类培养基的配制成的培养基。该类培养基的组成组成成分精确、清楚,重复性强成分精确、清楚,重复性强,但微
18、生物生长较慢,且价,但微生物生长较慢,且价格昂贵,故一般适于在实验室范围内他有关研生物营养需要、格昂贵,故一般适于在实验室范围内他有关研生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。如高氏培养基、察氏培养基等的研究工作。如高氏培养基、察氏培养基等.半组合培养基半组合培养基指一类主要由指一类主要由化学试剂配制化学试剂配制,同时还添,同时还添加某些加某些天然成分的培养基天然成分的培养基。以更有效地满足微生物对营养物。以更有效地满足微生物对营养物的需要。如马铃薯蔗糖培养基的需要。如马铃薯蔗糖培养基按照培养基性状来分按
19、照培养基性状来分固体、液体、半固体培养基固体、液体、半固体培养基2.培养基原料的培养基原料的质量控制量控制培养基原料的培养基原料的质量控制主要是量控制主要是琼脂、蛋白脂、蛋白胨、胆、胆盐、牛肉膏及酵母浸膏等的牛肉膏及酵母浸膏等的质量控制。量控制。琼脂:分脂:分为琼脂粉和脂粉和琼脂条,要求其溶于水后,脂条,要求其溶于水后,pH值约为7,透明无沉淀,用量不宜,透明无沉淀,用量不宜过多,一般多,一般为1.52.0(质量分数)。量分数)。蛋白蛋白胨:应为干燥的白色或微黄色的干燥的白色或微黄色的细粉末,粉末,pH值约为7而偏酸性,能溶于水。不同的微生物可利用不同的蛋白而偏酸性,能溶于水。不同的微生物可利
20、用不同的蛋白胨,在配制培养基在配制培养基时,应根据微生物的要求根据微生物的要求进行行选择。胆胆盐:应为浅黄色粉末,种浅黄色粉末,种类很多,可来自猪、牛、羊、很多,可来自猪、牛、羊、兔等。不同的胆兔等。不同的胆盐有不同的抑菌作用,因此有不同的抑菌作用,因此应根据培养基的根据培养基的要求要求进行行选择,不能互相代替。,不能互相代替。牛肉膏及酵母浸膏:牛肉膏及酵母浸膏:应为棕褐色半固体,溶于水后棕褐色半固体,溶于水后应透透明无沉淀。在培养基中加入牛肉膏及酵母浸膏后,明无沉淀。在培养基中加入牛肉膏及酵母浸膏后,应观察培察培养养细菌的生菌的生长情况,以情况,以对其效果其效果进行行检测。3)培养基性能的控
21、制)培养基性能的控制 物理性状物理性状主要是透明度、主要是透明度、pH值、硬度等。培养基、硬度等。培养基应有有较好的透明度,好的透明度,若有若有浑浊、沉淀、沉淀现象,象,则会直接影响会直接影响对细菌生菌生长情况的情况的观察。察。培养基的培养基的pH值应严格按照要求格按照要求进行校正,行校正,对于一些生化反于一些生化反应培养基,培养基,pH值的正的正误直接影响直接影响细菌的反菌的反应结果和果和对其其进行判行判断。固体培养基的硬度要适中,断。固体培养基的硬度要适中,过硬不利于硬不利于细菌的生菌的生长,过软又不利于划又不利于划线分离。保存菌株和分离。保存菌株和观察其运察其运动性的半固体培性的半固体培
22、养基的硬度也很重要,一般要根据养基的硬度也很重要,一般要根据琼脂的脂的质量适当考量适当考虑。生物学要求:微生物只有在适宜的培养基上,才生物学要求:微生物只有在适宜的培养基上,才能表能表现出出应有的生物学特性,而不同的微生物有不有的生物学特性,而不同的微生物有不同的培养要求。一些常用的同的培养要求。一些常用的选择性培养基,除了性培养基,除了对非目的菌有抑制作用外,非目的菌有抑制作用外,对目的菌或多或少也有一目的菌或多或少也有一定影响,因此就必定影响,因此就必须了解目的菌了解目的菌对该种培养基的敏种培养基的敏感程度和适感程度和适应性。性。细菌在不同的培养基上,其菌落菌在不同的培养基上,其菌落的大小
23、、形的大小、形态特征及特征及颜色的表色的表现是不同的,要是不同的,要检测培养基的性能如何,培养基的性能如何,应选择有代表性的典型菌有代表性的典型菌进行行分离培养,分离培养,观察其菌落的生察其菌落的生长情况是否典型。情况是否典型。4)染色液的)染色液的质量控制:在将染色液配制好后,量控制:在将染色液配制好后,应选用用标准菌株做阳性和阴性准菌株做阳性和阴性对照照试验,从而,从而鉴定其定其染色的性能。染色的性能。5)各种)各种诊断血清的断血清的质量控制:量控制:许多致病菌都要多致病菌都要进行血清学行血清学诊断。断。第五节第五节 食品微生物检验的一般程序食品微生物检验的一般程序 1食品微生物检验的一般
24、步骤食品微生物检验的一般步骤2检验前的准备检验前的准备3样品的采集样品的采集4样品的送检样品的送检5样品的处理方法样品的处理方法6致病菌检验参考菌群的选择致病菌检验参考菌群的选择7样品的检验样品的检验8检验结果的报告检验结果的报告一一.食品微生物检验的一般步骤食品微生物检验的一般步骤样样品品采采集集样样品品处处理理样样品品保保存存选选择择参参考考菌菌群群检检验验前前的的准准备备菌落总数菌落总数大肠菌群大肠菌群致致病病菌菌分离培养分离培养分离分离培养培养增增菌菌纯纯化化染色镜检染色镜检生化试验生化试验血清学试验血清学试验动物试验动物试验结果报告结果报告二二.检验前的准备检验前的准备1.准备好所需
25、的各种仪器。准备好所需的各种仪器。2.按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌,冷却后送无菌室备用。灭菌,冷却后送无菌室备用。3.准备好所用的各种试剂,做好普通营养琼脂或其他选准备好所用的各种试剂,做好普通营养琼脂或其他选择必需培养基。择必需培养基。4.做好无菌室或超净工作台的灭菌工作,提前做好无菌室或超净工作台的灭菌工作,提前1h灭菌灭菌3060min.5.工作衣、鞋、帽、等灭菌后备用。工作衣、鞋、帽、等灭菌后备用。6.工作人员进入无菌室后,实验没有完成之前不得随便工作人员进入无菌室后,实验没有完成之前不得随便出入无菌室。出入无菌室。三
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