【广西医药大学】优质课《微生物学》第五章-微生物的生长及其控制.ppt
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1、【广西医药大学】优质课全国特级教师 江新欢 博士教授微生物学微生物学第第五五章章 微生物的生长及其控制微生物的生长及其控制 第一节第一节第一节第一节 测定微生物生长繁殖的方法测定微生物生长繁殖的方法测定微生物生长繁殖的方法测定微生物生长繁殖的方法第二节第二节第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律微生物的生长规律微生物的生长规律第三节第三节第三节第三节 影响微生物生长的主要环境因素影响微生物生长的主要环境因素影响微生物生长的主要环境因素影响微生物生长的主要环境因素第四节第四节第四节第四节 微生物培养法概论微生物培养法概论微生物培养法概论微生物培养法概论第五节第五节第五节第五节 微生物生长
2、繁殖的控制微生物生长繁殖的控制微生物生长繁殖的控制微生物生长繁殖的控制 单个微生物细胞单个微生物细胞单个微生物细胞单个微生物细胞合适的外界条件,吸收营养物质,进行代谢。合适的外界条件,吸收营养物质,进行代谢。同化作用的速度超过了异化作用同化作用的速度超过了异化作用同化作用的速度超过了异化作用同化作用的速度超过了异化作用个体的生长个体的生长原生质的总量(重量、体积、大小)就不断增加原生质的总量(重量、体积、大小)就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就如果各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就如果各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就如果各细胞组分
3、是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就会发生繁殖,引起个体数目的增加。会发生繁殖,引起个体数目的增加。会发生繁殖,引起个体数目的增加。会发生繁殖,引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体内各个个体的进一步生长群体的生长群体的生长第一节第一节 测定微生物生长繁殖的方法测定微生物生长繁殖的方法微生物生长的测定:个体计数、群体重量测定和微生物生长的测定:个体计数、群体重量测定和微生物生长的测定:个体计数、群体重量测定和微生物生长的测定:个体计数、群体重量测定和群体生理指标测定。群体生理指标测定。群体生理指标测定。群体生理指标测定。目的:目的:目的:目的:l l评价培养条件、营养物质等对微
4、生物生长的影响;评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响;评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响;评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响;l l评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死或杀死或杀死或杀死)作用的效果;作用的效果;作用的效果;作用的效果;l l客观地反映微生物生长的规律。客观地反映微生物生长的规律。客观地反映微生物生长的规律。客观地反映微生物生长的规律。一、测生长一、测生长量:量:单位时间里微生物重量上的单位时间里微生物重量上的变化。变化。(一)直接法(精确的称干重法
5、;粗放的测(一)直接法(精确的称干重法;粗放的测体积法)体积法)(二)间接法(比浊法,生理指标法)(二)间接法(比浊法,生理指标法)(一)直接法(一)直接法将将一一定定量量的的菌菌液液中中的的菌菌体体通通过过离离心心或或过过滤滤分分离离出出来来,然然后后烘烘干干(干干燥燥温温度度可可采采用用105、100或或80)、称称重重。一一般般干干重重为为湿湿重重的的10%20%,而而一一个个细细菌菌细细胞胞一一般重约般重约10-1210-13g。该法适合菌液浓度较高的样品。该法适合菌液浓度较高的样品。(二)间接法(二)间接法1 1、比比比比浊浊浊浊法法法法:借借借借助助助助于于于于分分分分光光光光光光
6、光光度度度度计计计计,在在在在一一一一定定定定波波波波长长长长(450650nm450650nm波波波波段段段段)下下下下测测测测定定定定菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液的的的的光光光光密密密密度度度度,就就就就可反应出菌液的浓度。可反应出菌液的浓度。可反应出菌液的浓度。可反应出菌液的浓度。原原原原理理理理:在在在在一一一一定定定定范范范范围围围围内内内内,菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液中中中中的的的的细细细细胞胞胞胞浓浓浓浓度度度度与与与与混混混混浊浊浊浊度度度度成正比,即与光密度成正比,菌数越多,光密度越大。成正比,即与光密度成正比,菌数越多,光密度越大。成正比,即与光密度成正比,菌数越多,光密度越大。
7、成正比,即与光密度成正比,菌数越多,光密度越大。特点:快速、简便。特点:快速、简便。特点:快速、简便。特点:快速、简便。如何定量二者关系呢?如何定量二者关系呢?浊度仪浊度仪绘制标准曲线绘制标准曲线绘制标准曲线绘制标准曲线测菌液浊度,对照标准曲线得出细菌数量测菌液浊度,对照标准曲线得出细菌数量测菌液浊度,对照标准曲线得出细菌数量测菌液浊度,对照标准曲线得出细菌数量2 2、生理指标法、生理指标法测含氮量:蛋白质是细胞的主要物质,含量稳定,而氮是测含氮量:蛋白质是细胞的主要物质,含量稳定,而氮是蛋白质的主要成分,通过测含氮量就可推知微生物的浓度。蛋白质的主要成分,通过测含氮量就可推知微生物的浓度。其
8、他方法:含碳、磷、其他方法:含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物耗氧量、消耗底物量、产量、产CO2、产酸、产热、粘度等,都可用于生长量的测定。产酸、产热、粘度等,都可用于生长量的测定。二、计繁殖数二、计繁殖数(单细胞微生物细胞个体数目(单细胞微生物细胞个体数目的检测法)的检测法)(一)直接法:血球计数板(一)直接法:血球计数板(二)间接法:(活菌)平板菌落计数法、(二)间接法:(活菌)平板菌落计数法、厌氧菌培养厌氧菌培养血球计数板法血球计数板法血球计数板法血球计数板法:(一)直接法(一)直接法(一)直接法(一)直接法细胞密度(细胞密度(4个大格细胞总数个大格细胞总数/4)104个个/ml
9、;(二)间接法(活菌计数法)(二)间接法(活菌计数法)平平平平板板板板菌菌菌菌落落落落计计计计数数数数法法法法膜过滤培养法膜过滤培养法微生物生长测定方法比较微生物生长测定方法比较微生物生长测定方法比较微生物生长测定方法比较测测定定细细胞胞数数目目方法方法特点与应用特点与应用血球计数板法血球计数板法 较快速简便,但较费时较快速简便,但较费时薄膜过滤染色法薄膜过滤染色法 快速简便,快速简便,适于含菌数很低的空气、水等中的总菌计数适于含菌数很低的空气、水等中的总菌计数 平皿菌落计数法平皿菌落计数法 简易价廉,但花费时间较长,不能立刻知道结果简易价廉,但花费时间较长,不能立刻知道结果测测定定物物质质量
10、量比浊法比浊法 快速简便,敏感度低,适于不发酵液或液体中的快速快速简便,敏感度低,适于不发酵液或液体中的快速 总细胞数估计,但需事先标定总细胞数估计,但需事先标定细胞湿重法细胞湿重法 较为简便,但含水量不定,准确度差较为简便,但含水量不定,准确度差细胞成分含量法细胞成分含量法 如测定蛋白质、核酸、还原糖的含量等如测定蛋白质、核酸、还原糖的含量等细胞干重法细胞干重法 较为费时,易受颗粒杂质干扰,敏感度低较为费时,易受颗粒杂质干扰,敏感度低第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律一、获得微生物纯培养的方法一、获得微生物纯培养的方法一、获得微生物纯培养的方法一、获得微生物纯培养的方法概念:从一
11、个细胞得到的后代称为纯培养。概念:从一个细胞得到的后代称为纯培养。概念:从一个细胞得到的后代称为纯培养。概念:从一个细胞得到的后代称为纯培养。方法:稀释倒平板法;划线法。方法:稀释倒平板法;划线法。方法:稀释倒平板法;划线法。方法:稀释倒平板法;划线法。二、微生物的个体生长和群体的同步生长二、微生物的个体生长和群体的同步生长二、微生物的个体生长和群体的同步生长二、微生物的个体生长和群体的同步生长 使用同步培养技术,即设法使群体中的所有细使用同步培养技术,即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中,胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中,然后分析此群体的各种生物化学特征,从而了
12、然后分析此群体的各种生物化学特征,从而了解单个细胞所发生的变化。解单个细胞所发生的变化。通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态即的状态即同步生长同步生长。进行同步分裂的细胞称为进行同步分裂的细胞称为同步细胞同步细胞。获得同步生长的方法获得同步生长的方法获得同步生长的方法主要有两类:获得同步生长的方法主要有两类:获得同步生长的方法主要有两类:获得同步生长的方法主要有两类:(1 1)环境条件诱导法:抗生素、变换温度、光线、)环境条件诱导法:抗生素、变换温度、光线、)环境条件诱导法:抗生素、变换温度、光线、)环境条件诱导法:抗生素、变换温度、光线、培养
13、基等,造成与正常细胞周期不同的周期变化。培养基等,造成与正常细胞周期不同的周期变化。培养基等,造成与正常细胞周期不同的周期变化。培养基等,造成与正常细胞周期不同的周期变化。(2 2)机械筛选法:选择性过滤、梯度离心或膜洗脱)机械筛选法:选择性过滤、梯度离心或膜洗脱)机械筛选法:选择性过滤、梯度离心或膜洗脱)机械筛选法:选择性过滤、梯度离心或膜洗脱法。法。法。法。物理方法,随机选择,不影响细胞代谢。物理方法,随机选择,不影响细胞代谢。物理方法,随机选择,不影响细胞代谢。物理方法,随机选择,不影响细胞代谢。硝酸纤维素膜法硝酸纤维素膜法细菌细胞会粘附于具有相反电荷的硝酸纤维微孔滤膜上。细菌细胞会粘附
14、于具有相反电荷的硝酸纤维微孔滤膜上。细菌细胞会粘附于具有相反电荷的硝酸纤维微孔滤膜上。细菌细胞会粘附于具有相反电荷的硝酸纤维微孔滤膜上。三、单细胞微生物的典型生长曲线三、单细胞微生物的典型生长曲线将将少少量量纯纯种种单单细细胞胞微微生生物物接接种种到到恒恒容容积积的的液液体体培培养养基基中中后后,在在适适宜宜的的温温度度、通通气气(厌厌氧氧菌菌除除外外)等等条条件件下下,它它们们的的群群体体会会有有规规律律地地生生长长起起来来。每每隔隔一一定定时时间间取取样样,测测菌菌细细胞胞数数目目。以以细细胞胞数数目目的的对对数数值值作作纵纵坐坐标标,以以培培养养时时间间作作横横坐坐标标,可可以以画画出出
15、一一条条有有规规律律的的曲曲线线即即单单细细胞胞微微生生物物的的典典型型生生长长曲曲线线。生生长长曲曲线线代代表表了了单单细细胞胞微微生生物物在在新新的的环环境境中中从从开开始始生生长长、分裂分裂直至直至死亡死亡的整个动态变化过程。的整个动态变化过程。单细胞微生物的典型生长曲线单细胞微生物的典型生长曲线单细胞微生物的典型生长曲线单细胞微生物的典型生长曲线 延延滞滞期期指指数数期期稳定期稳定期衰亡期衰亡期又称:停滞期、调整期、适应期又称:停滞期、调整期、适应期“万事开头难万事开头难”1、特点:、特点:生长速率常数生长速率常数R=0;细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长;细胞内细胞内RNA特别是特
16、别是rRNA含量增高,原生质嗜碱性增强含量增高,原生质嗜碱性增强;合成代谢活跃(核糖体、酶类、合成代谢活跃(核糖体、酶类、ATP合成加快),易产合成加快),易产生诱导酶生诱导酶;对外界不良条件反应敏感(如氯化钠浓度、温度、抗生对外界不良条件反应敏感(如氯化钠浓度、温度、抗生素等理、化学药物)。素等理、化学药物)。(一)(一)延滞期延滞期2、在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期,措施有、在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期,措施有:接种龄:对数生长期的菌种接种接种龄:对数生长期的菌种接种,子代停滞期短;稳定期子代停滞期短;稳定期的菌种接种,子代停滞期居中;停滞期或衰亡期菌种接种,的菌种接种,子代停滞期居
17、中;停滞期或衰亡期菌种接种,子代停滞期长。子代停滞期长。增加接种量;一般来说,增加接种量;一般来说,接种量增大可缩短甚至消除延接种量增大可缩短甚至消除延迟期(发酵工业上一般采用迟期(发酵工业上一般采用1/10的接种量)。的接种量)。调整培养基的成分,应适当丰富,且发酵培养基成分尽调整培养基的成分,应适当丰富,且发酵培养基成分尽量与种子培养基的成分接近。量与种子培养基的成分接近。(二)指数期(二)指数期1、特点:、特点:生长速率常数生长速率常数R最大,即代时最短最大,即代时最短;细胞进行平衡生长,细胞进行平衡生长,菌体大小、形态、菌体大小、形态、生理特征等比较一致生理特征等比较一致;酶系活跃,代
18、谢最旺盛。酶系活跃,代谢最旺盛。x2x1t2t1t2 -t13.322(lgx2-lgx1)u生长速率常数生长速率常数R=t2 -t13.322(lgx2-lgx1)u代时代时G=u繁殖代数繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)2、指数期中的的、指数期中的的三个重要参数三个重要参数一一一一 些些些些 细细细细 菌菌菌菌 的的的的 代代代代 时时时时菌名菌名菌名菌名培养基培养基培养基培养基 培养温度培养温度培养温度培养温度 代时代时代时代时E.coliE.coli(大肠杆菌)大肠杆菌)大肠杆菌)大肠杆菌)肉汤肉汤肉汤肉汤 373717min17minE.coliE.coli 牛奶牛奶牛奶
19、牛奶 373712.512.5EnterobacterEnterobacter aerogenesaerogenes(产气肠细菌)产气肠细菌)产气肠细菌)产气肠细菌)肉汤或牛奶肉汤或牛奶肉汤或牛奶肉汤或牛奶 3737 16181618E.E.aerogenesaerogenes 组合组合组合组合 373729442944B.B.CereusCereus(蜡状芽孢杆菌)蜡状芽孢杆菌)蜡状芽孢杆菌)蜡状芽孢杆菌)肉汤肉汤肉汤肉汤30301818B.B.thermophilusthermophilus(嗜热芽孢杆菌)嗜热芽孢杆菌)嗜热芽孢杆菌)嗜热芽孢杆菌)肉汤肉汤肉汤肉汤555518.318.3L
20、actobacillus acidophilusLactobacillus acidophilus(嗜酸乳杆菌)嗜酸乳杆菌)嗜酸乳杆菌)嗜酸乳杆菌)牛奶牛奶牛奶牛奶373766876687Streptococcus Streptococcus lactislactis(乳酸链球菌)乳酸链球菌)乳酸链球菌)乳酸链球菌)牛奶牛奶牛奶牛奶37372626S.S.lactislactis 乳糖肉汤乳糖肉汤乳糖肉汤乳糖肉汤37374848AzotobacterAzotobacter chroococcumchroococcum(褐球固氮菌)褐球固氮菌)褐球固氮菌)褐球固氮菌)葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖25
21、253444634446Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis(结核分枝杆菌)组合结核分枝杆菌)组合结核分枝杆菌)组合结核分枝杆菌)组合37377929379293NitrobacterNitrobacter agilisagilis(活跃硝化杆菌)活跃硝化杆菌)活跃硝化杆菌)活跃硝化杆菌)组合组合组合组合272712001200(1 1)菌种:不同菌种其代时差别极大。)菌种:不同菌种其代时差别极大。)菌种:不同菌种其代时差别极大。)菌种:不同菌种其代时差别极大。(2 2)营养成分:同一种微生物,在营养丰富的培养基上)营养成分:
22、同一种微生物,在营养丰富的培养基上)营养成分:同一种微生物,在营养丰富的培养基上)营养成分:同一种微生物,在营养丰富的培养基上生长时,其代时较短,反之则长。生长时,其代时较短,反之则长。生长时,其代时较短,反之则长。生长时,其代时较短,反之则长。(3 3)营养物浓度:既影响微生物的生长速率,又影响它)营养物浓度:既影响微生物的生长速率,又影响它)营养物浓度:既影响微生物的生长速率,又影响它)营养物浓度:既影响微生物的生长速率,又影响它的生长总量。的生长总量。的生长总量。的生长总量。(浓度(浓度(浓度(浓度0.10.12.0mg/mL2.0mg/mL影响生长速率,浓度影响生长速率,浓度影响生长速
23、率,浓度影响生长速率,浓度2.02.08.0mg/mL8.0mg/mL时影响最终产量)(图)时影响最终产量)(图)时影响最终产量)(图)时影响最终产量)(图)(4 4)培养温度:温度对微生物的生长速率明显的影响。)培养温度:温度对微生物的生长速率明显的影响。)培养温度:温度对微生物的生长速率明显的影响。)培养温度:温度对微生物的生长速率明显的影响。3、影响指数期微生物代时长短的因素、影响指数期微生物代时长短的因素营养物浓度与对数期生长速率和产量营养物浓度与对数期生长速率和产量8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1m
24、g/ml只最大收只最大收获量受影响获量受影响生长速度和最大生长速度和最大收获量受影响收获量受影响时间时间细胞数或菌体量细胞数或菌体量4 4、应用、应用指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点。细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点。细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点。细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点。(1 1 1 1)用作代谢、生理等研究的良好材料;)用作代谢、生理等研究的良好材料;)用作代谢、生理等研究的良好材料;)用
25、作代谢、生理等研究的良好材料;(2 2 2 2)是增殖噬菌体的最适宿主;)是增殖噬菌体的最适宿主;)是增殖噬菌体的最适宿主;)是增殖噬菌体的最适宿主;(3 3 3 3)是发酵工业中用种子的最佳材料。)是发酵工业中用种子的最佳材料。)是发酵工业中用种子的最佳材料。)是发酵工业中用种子的最佳材料。(4 4 4 4)进行染色、形态观察等进行染色、形态观察等进行染色、形态观察等进行染色、形态观察等的良好材料的良好材料的良好材料的良好材料。(三)稳定期(三)稳定期1、特点:、特点:(1)R=0,即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等,即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等,或正生长与负生长相等的动态平衡
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