溶血空斑实验.ppt
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1、现在学习的是第1页,共17页实验目的 掌握溶血空斑试验检测原理掌握溶血空斑试验检测原理 掌握溶血空斑的操作方法掌握溶血空斑的操作方法现在学习的是第2页,共17页实验原理溶血空斑实验(溶血空斑实验(plaque forming cell assay,PFC)体体外检测单个抗体形成细胞(外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法。淋巴细胞)的一种方法。其原理是将绵羊红细胞(其原理是将绵羊红细胞(SRBCSRBC)免疫家兔或小鼠,)免疫家兔或小鼠,取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液,与一定量取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液,与一定量的的SRBCSRBC结合,在结合,在3737条件下免疫活性
2、淋巴细胞释放出条件下免疫活性淋巴细胞释放出溶血素,在补体的参与下,可溶解周围的绵羊红细胞,溶血素,在补体的参与下,可溶解周围的绵羊红细胞,从而在每个抗体形成细胞周围形成一个可见的溶血空从而在每个抗体形成细胞周围形成一个可见的溶血空斑。斑。现在学习的是第3页,共17页一个空斑代表一个抗体形成细胞(即一个空斑代表一个抗体形成细胞(即B B细细胞胞 ),空斑的数量反映机体的体液免),空斑的数量反映机体的体液免疫功能。疫功能。空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高,多少。由于溶血空斑试验具有特异性高,筛选力强,可直接观察等优点,故可用筛选
3、力强,可直接观察等优点,故可用做判定免疫功能的指标,观察免疫应答做判定免疫功能的指标,观察免疫应答的动力学变化,并可进行抗体种类及亚的动力学变化,并可进行抗体种类及亚类的研究。类的研究。现在学习的是第4页,共17页现在学习的是第5页,共17页实验材料与试剂 器材:平皿、器材:平皿、3737水浴箱、离心机、显微水浴箱、离心机、显微镜镜 试剂:试剂:SRBCSRBC悬液:取无菌脱纤维羊血,用悬液:取无菌脱纤维羊血,用NSNS或或PBSPBS离心洗涤离心洗涤3 3次,每次以次,每次以2000rpm2000rpm,5min5min,用,用PH7.2PH7.2的的PBSPBS(含(含CaCa2+2+、M
4、gMg2+2+)悬成细胞浓度)悬成细胞浓度为为2.002.0010109 9个个/mL/mL现在学习的是第6页,共17页HanksHanks液(含液(含CaCa2+2+、MgMg2+2+)底层基(底层基(1.4%1.4%)和表层基()和表层基(0.7%0.7%):):将琼脂糖用将琼脂糖用HanksHanks液配成液配成1.4%1.4%和和0.7%0.7%两种两种浓度。将表层基分装于小试管中,每管浓度。将表层基分装于小试管中,每管2ml2ml补体:新鲜豚鼠血清补体:新鲜豚鼠血清小牛血清:小牛血清:5656灭活灭活 30min30min现在学习的是第7页,共17页实验步骤免疫脾细胞悬液的制备免疫脾
5、细胞悬液的制备小鼠免疫:每只小鼠经尾静脉注入上述小鼠免疫:每只小鼠经尾静脉注入上述SRBCSRBC悬液悬液2.00104个个/0.2ml0.2ml或者腹腔注射或者腹腔注射4.00108 个个/1ml1ml。单个脾细胞悬液的制备:将免疫后第四天的小鼠拉颈单个脾细胞悬液的制备:将免疫后第四天的小鼠拉颈处死,解剖取出脾脏,放入处死,解剖取出脾脏,放入PH7.2PH7.2的的PBSPBS中漂洗,去掉中漂洗,去掉结缔组织,加入适量的结缔组织,加入适量的PBSPBS,用镊子挤压脾脏,稍,用镊子挤压脾脏,稍静置,吸上清液至离心管中,静置,吸上清液至离心管中,2500r/min2500r/min离心离心5mi
6、n5min,弃上清后,定量加入弃上清后,定量加入PBSPBS液液1ml1ml,混匀,再用,混匀,再用PBSPBS液稀释液稀释1010倍(浓度约为倍(浓度约为5 510106 6个个/ml/ml)现在学习的是第8页,共17页(二)倾注底层琼脂(二)倾注底层琼脂 将将1.4%1.4%琼脂凝胶加热融化后,倾注于琼脂凝胶加热融化后,倾注于水平位置的平皿内,每皿水平位置的平皿内,每皿6ml6ml,凝固,凝固后,用前置后,用前置5555水浴锅中预温。水浴锅中预温。现在学习的是第9页,共17页(三)表层琼脂的制备(三)表层琼脂的制备 将将0.7%0.7%的琼脂融化后,置于的琼脂融化后,置于5555恒温恒温水
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