多聚酶链式反应 扩增片段.ppt
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1、多聚酶链式反应 扩增片段现在学习的是第1页,共58页一、实验目的一、实验目的n了解了解PCR的基本原理,学习的基本原理,学习PCR的基本操作技术。的基本操作技术。现在学习的是第2页,共58页二、实验原理二、实验原理n多聚酶链式反应(多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,简简称称PCR)是体外酶促合成特异)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期,通过多次循环反应,使目的环周期,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。
2、其原理如下:将待扩增的其原理如下:将待扩增的DNA置于高温下使之解链,人工合置于高温下使之解链,人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合;互补结合;DNA聚合酶在聚合酶在72将单核苷酸从引物的将单核苷酸从引物的3端开始端开始掺入,沿模板掺入,沿模板53端方向延伸,合成端方向延伸,合成DNA的新互补链。反复的新互补链。反复进行这种变性、退火和延伸反应循环,可使两引物限定范围内的进行这种变性、退火和延伸反应循环,可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的序列以指数形式扩增。循环的次数主
3、要取决于模板的浓度,从理论上讲一个模板浓度,从理论上讲一个模板DNA分子经分子经20次循环扩增后可达次循环扩增后可达106。现在学习的是第3页,共58页PCRPCR的基本原理的基本原理 变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制一生二,二生四,四生万物一生二,二生四,四生万物 PCR PCR三步曲三步曲变性变性 90909797退火退火 45456565延伸延伸 7272左右左右PCRPCR过程过程现在学习的是第4页,共58页(二二)PCR的反应过程的反应过程n变性变性-复性复性-延伸延伸n多重循环多重循环(n)n模板以模板以2En扩增扩增短片段以指数式扩增短片段以指数式扩增长片段以线性式扩
4、增长片段以线性式扩增最终主产物片段长度在最终主产物片段长度在P1-P2之间之间现在学习的是第5页,共58页nPCR技术广泛应用于分子生物学等各个领域。技术广泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析,又可用于突变体和重组体的构建、基因表析,又可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及医学鉴定等传染病的诊断、肿瘤机制的探索及医学鉴定等多方面,也被广泛运用于刑侦物证鉴定、亲子多方面,也被广泛运用于刑侦物证鉴定、亲子鉴定及古分子系
5、统学研究等其他领域。鉴定及古分子系统学研究等其他领域。现在学习的是第6页,共58页三、实验材料、器材及试剂三、实验材料、器材及试剂n待扩增的模板待扩增的模板DNA;nDNA热循环仪,电泳仪,电泳槽,台式离心机,热循环仪,电泳仪,电泳槽,台式离心机,紫外检测仪,紫外检测仪,1.5ml离心管架,移液器,离心管架,移液器,1.5ml离离心管,心管,0.2ml离心管,枪头等。离心管,枪头等。ndNTPs,Taq酶,引物一对,酶,引物一对,10PCRReactionBuffer,TdH2O现在学习的是第7页,共58页 PCR PCR反应体系的五要素反应体系的五要素:引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、
6、模板和、模板和MgMg2+2+Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 来自水生栖热菌来自水生栖热菌 Thermus aquaticusThermus aquaticus 良好的耐热性良好的耐热性 MgMg2+2+依赖性依赖性 无校读功能无校读功能现在学习的是第8页,共58页ndNTP,deoxy-ribonucleoside triphosphate(三磷酸脱氧核糖核苷)的缩写。是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称,N代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。在生物DNA、RNA合成中,以及各种PCR(RT-PCR、Real-time PCR)中 现在学习的是第
7、9页,共58页n1.PCR反应反应nPCR反应混合液的配制(反应混合液的配制(n为反应数):为反应数):nn2.0l反应缓冲液(即反应缓冲液(即10PCR反应缓冲液反应缓冲液 其其中含中含15mMMgCl2)nn2.0ldNTP(2mM,each)nn1.5l引物引物F(2M)nn1.5l引物引物R(2M)nn0.1lTaq酶酶(5U/l)n混匀混匀,取取19l分别加入分别加入n个个0.2mlPCR管中管中,各管加入模板各管加入模板DNA1l,轻轻用手摔一下轻轻用手摔一下.现在学习的是第10页,共58页n无菌薄壁管中无菌薄壁管中顺序加入顺序加入反应体系各成分反应体系各成分:双双/三蒸水三蒸水
8、l10缓冲液缓冲液2.5 l25mmol/LMg2+2.5 l4dNTP2.0 l50umol/L引物引物12.0 l50umol/L引物引物22.0 l模板模板DNA1-2 lTaqDNA多聚酶多聚酶1.0 l25.0 l轻弹管壁,使各成分充分混匀!轻弹管壁,使各成分充分混匀!实验操作(实验操作(1)PCR反应体系:反应体系:四、实验步骤四、实验步骤现在学习的是第11页,共58页实验操作(实验操作(2)n设定循环程序设定循环程序:阶一阶一:943m 943m 阶二阶二:(9430s-9430s-55 55 1m1m-72721m1m )25253535循环循环阶三阶三:72725 510m1
9、0mPCR反应在带热盖的反应在带热盖的PCR仪上进行仪上进行,大大约需要两个半小时约需要两个半小时.现在学习的是第12页,共58页操作提示操作提示n1、一切器具均经高压灭菌、一切器具均经高压灭菌-烘烘干干-冷却后使用;冷却后使用;n2、各试剂小份分装,、各试剂小份分装,-20保存,现用现取;保存,现用现取;n3、酶的取用不离开冰浴;、酶的取用不离开冰浴;n取液吸头、离心管均取液吸头、离心管均一次性一次性使用,及时更换;使用,及时更换;现在学习的是第13页,共58页2.PCR产物的检测产物的检测n制备制备1.0%的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶n取取5lPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳产物进行琼脂糖凝胶电泳
10、,紫紫外检测仪下观察外检测仪下观察,记录结果记录结果.现在学习的是第14页,共58页n电泳结果电泳结果有无目标条带出现有无目标条带出现,可判别,可判别+/-结果;结果;n根据条带根据条带宽度和亮度宽度和亮度,可直观判断扩增产量;,可直观判断扩增产量;n关于关于PCR假阴性、假阳性及非特异扩增问题。假阴性、假阳性及非特异扩增问题。电泳检验电泳检验PCR结果、分析与评价结果、分析与评价现在学习的是第15页,共58页PCR扩增扩增NGF基因(大鼠)基因(大鼠)ratbeta-nervegrowthfactorsequence5-301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat
11、 cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct421 ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc541 accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga
12、gactccgttc -3Perim 1:(5)gat cgg cgt aca ggc aga ac(3)328-347Perim 2:(3)cgc ggg gtg aac gga gtc tc(5)529-548预期扩增长度:预期扩增长度:220bp现在学习的是第16页,共58页DNAMarkerNGF2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp220bp现在学习的是第17页,共58页关于关于PCR假阴性、假阳性问题假阴性、假阳性问题n每组每组PCR都要设立阴性对照都要设立阴性对照(加无关加无关DNA,而,而不是不加不是不加DNA),以检测有无污染;),以检测有无污染;n
13、每组每组PCR都要设立阳性对照(加肯定的都要设立阳性对照(加肯定的DNA或或前次前次PCR产物),以检测产物),以检测PCR的效率;的效率;n对假阴性问题,可通过重复实验排除错误、改对假阴性问题,可通过重复实验排除错误、改善反应条件(用梯度实验选择复性温度)等排善反应条件(用梯度实验选择复性温度)等排查、排除之;查、排除之;n假阳性多数都是模板假阳性多数都是模板DNA污染的问题,查实后污染的问题,查实后必须更换所有试剂;必须更换所有试剂;n现在学习的是第18页,共58页关于关于PCR非特异性扩增问题:非特异性扩增问题:引物特异性引物特异性引物纯度引物纯度两条引物的两条引物的Tm值值模板纯度模板
14、纯度模板二级结构模板二级结构退火温度(时间)退火温度(时间)反应体系中引物、反应体系中引物、dNTP、Mg+、模板、模板、Taq酶浓度。酶浓度。现在学习的是第19页,共58页实验延伸实验延伸n检索了解检索了解PCR的进展:的进展:n逆转录逆转录PCR;n巢式巢式PCR;n反向反向PCR;n差示差示PCR;n单链构象多态性单链构象多态性PCRPCR;n实时定量实时定量PCRPCR;n 现在学习的是第20页,共58页逆转录逆转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligodT,逆转录酶逆转录酶特异性引物特异性引物,Taq酶酶用途用途:获得所需获得所需cDNAcDNA片段;检测基因表达片段
15、;检测基因表达注意问题:注意问题:1、PCR效率差异,重复性效率差异,重复性2、内参选定、内参选定3、共同扩增、共同扩增4、扩增片段位置、扩增片段位置5、mRNA丰度丰度现在学习的是第21页,共58页巢式巢式PCR采用两对引物进行采用两对引物进行PCR,其中第二对引物位于第一对引物内,其中第二对引物位于第一对引物内P1上上P1下下P2上上P2下下用途:验证第一次用途:验证第一次PCR产物的特异性产物的特异性进行特殊进行特殊PCR,如合成探针模板,如合成探针模板现在学习的是第22页,共58页反向反向PCR已知序列已知序列PCR用途:用途:未知序列的研究未知序列的研究现在学习的是第23页,共58页
16、差示差示PCR(DD-PCR)利用特殊设计的引物,在利用特殊设计的引物,在RT的基础上进行的基础上进行PCR,以研究,以研究不同基因的表达状况。不同基因的表达状况。肿肿瘤瘤组组织织正正常常组组织织现在学习的是第24页,共58页DNA分子在电泳中的行为取决于分子量分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中电泳,与正常产物变形后于中性胶中电泳,与正常对照比较,若电泳行为异常,则认为内含对照比较,若电泳行为异常,则认为内含突变的碱基。突变的碱基。单链构象多态性单链构象多态性PCR(SSCP-PCR)PCR(SSC
17、P-PCR)现在学习的是第25页,共58页 PCR PCR引物设计引物设计1.1.一对引物,分别与靶一对引物,分别与靶DNA5DNA5和和3 3端互补端互补2.2.长度:长度:15153030个核苷酸个核苷酸3.3.引物内、引物间不应有互补序列引物内、引物间不应有互补序列4.4.引物与非特异扩增区无同源性引物与非特异扩增区无同源性引物的设计可以参照:引物的设计可以参照:两分钟两分钟StepByStep学会引物设计软件学会引物设计软件Primerpremier5.0/oligo软件软件核酸基因技术讨论版核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版生物信息学讨论版/PCR技术讨论版技术讨论版现在学习的是第
18、26页,共58页引物设计:引物设计:1.长度在长度在15-30bp,GC含量在含量在45-55%之间。之间。Tm=4(G+C)+2(A+T)。2.碱基分布表现出随机性,避免相同碱基连续碱基分布表现出随机性,避免相同碱基连续排列。排列。3.3不能与引物内部互补,以免形成二级结构。不能与引物内部互补,以免形成二级结构。4.两个引物各自的两个引物各自的3不能互补,以免形成自身不能互补,以免形成自身扩增。扩增。5.引物必须经引物必须经GenBank查询后,证实没有与其他查询后,证实没有与其他非目的非目的DNA高度互补,才能使用。高度互补,才能使用。现在学习的是第27页,共58页http:/www.nc
19、bi.nlm.nih.gov使用使用blast程序,输入引物序列,程序,输入引物序列,等待结果报告。等待结果报告。GenBank网址:网址:现在学习的是第28页,共58页http:/www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgihttp:/ g=10-6-6)水平水平3.3.简便、快速简便、快速:PCRPCR反应一般在反应一般在2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增反应反应 4.4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低:DNA DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组
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