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1、多聚酶链式反应扩增片段第1页,共13页,编辑于2022年,星期六自学提纲:l知识回顾:知识回顾:l1.DNA分子的结构(外侧、内侧、基本单位);分子的结构(外侧、内侧、基本单位);2.DNA复制过程和特点;复制过程和特点;l3.PCR技术概念及应用。技术概念及应用。l基本概念:变性、复性、基本概念:变性、复性、Taq DNA聚合酶、引物聚合酶、引物l理解理解PCR技术的原理技术的原理l掌握掌握PCR技术的全过程技术的全过程l比较比较PCR技术和体内技术和体内DNA复制的异同点。复制的异同点。第2页,共13页,编辑于2022年,星期六1、DNA分子的分子的3 端与端与5 端端-OH端为端为3 ;
2、磷酸基团的末端为磷酸基团的末端为5。2、DNA分子由两条分子由两条反向平行反向平行的脱氧核苷酸的脱氧核苷酸链根据链根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则形成形成氢键氢键连接而成。连接而成。第3页,共13页,编辑于2022年,星期六解旋酶解旋酶DNA母链母链4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物(引物(RNA)打开打开DNA双链双链模板模板合成子链原料合成子链原料催化子链合成催化子链合成使使DNA聚合酶能从引聚合酶能从引物物3端开始连接脱氧端开始连接脱氧核苷酸核苷酸 思考:思考:3、体内体内DNA复制的条件复制的条件是什么?是什么?体体外扩增外扩增DNA 如何提供相似环境?如何提供相似环
3、境?变性(变性(80-100)Taq聚合酶(耐高温)聚合酶(耐高温)1530个核苷酸构成个核苷酸构成DNA或或RNA第4页,共13页,编辑于2022年,星期六DNA双链双链单链单链变性(加热变性(加热80-100)复性(缓慢冷却)复性(缓慢冷却)4、DNA 分子的热变性原理:分子的热变性原理:变性的目的:变性的目的:复性的目的:复性的目的:解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单链与两条单链的结合的结合第5页,共13页,编辑于2022年,星期六一、PCR技术的原理l利用利用DNA分子的分子的热变性热变性原理,通过控原理,通过控 制制温度温度来控制双链的来控制双链的解聚解聚与与结
4、合,结合,从而完成从而完成体外体外DAN分子的扩增分子的扩增。l体外体外DNA复制的条件:复制的条件:四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、耐高温的聚合酶、引物、模板;缓冲溶液和模板;缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。严格控制温度的温控设备。l复制的方向:复制的方向:子链的子链的5 端向端向 3端延伸。端延伸。第6页,共13页,编辑于2022年,星期六二、二、PCR的反应过程的反应过程每个循环包括:每个循环包括:变性变性 复性复性延伸延伸 从第二轮循环开始,上一次循环的产从第二轮循环开始,上一次循环的产物也可以作为模板参与反应,并且物也可以作为模板参与反应,并且由引物由引物延伸
5、而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合,进结合,进行行DNADNA的延伸,的延伸,这样,这样,DNADNA聚合酶只能特异聚合酶只能特异性地复制性地复制处于两个引物之间的处于两个引物之间的DNADNA序列序列,使,使这段固定长度的序列这段固定长度的序列呈指数扩增呈指数扩增。第7页,共13页,编辑于2022年,星期六三、实验步骤:三、实验步骤:准备准备好好PCR反应体系的配方反应体系的配方用微量用微量移液移液器按配方在往微量离器按配方在往微量离心管中加入各组分心管中加入各组分盖严盖子,用手指轻轻弹击盖严盖子,用手指轻轻弹击管壁管壁混合混合反应液反应液离心离心10分钟分钟将离心管放
6、入将离心管放入PCR仪上,设置好仪上,设置好循环程序进行循环程序进行反应反应第8页,共13页,编辑于2022年,星期六注意事项:详见操作提示注意事项:详见操作提示 四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定:稀释含量的测定:稀释对照调零对照调零测定测定计算(公式见计算(公式见P63)波长波长260nm处处读数读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照50倍倍第9页,共13页,编辑于2022年,星期六PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制的区别:复制的区别:1.PCR不需要解旋酶;体内DNA复制需要;2.PCR需要耐热的DNA聚合酶(常用TaqDNA聚合酶),而生物体内的聚合酶在高温时会
7、变性;3.PCR一般要经历三十多次循环,而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。第10页,共13页,编辑于2022年,星期六练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用,错误的一项是技术的应用,错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定序列测定第11页,共13页,编辑于2022年,星期六2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸?端延伸?3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作第12页,共13页,编辑于2022年,星期六4、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A 反复洗涤反复洗涤 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高压灭菌高压灭菌 D 在在20 储存储存第13页,共13页,编辑于2022年,星期六
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