蛋白质工程概论课件.ppt
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1、蛋白质工程概论第1页,此课件共55页哦前言v基因工程诞生基因工程诞生1010周年之际著名科学家周年之际著名科学家Kevin M.UlmerKevin M.Ulmer于于19831983年在年在SCIENCE(VOL.219)SCIENCE(VOL.219)发表了论文发表了论文 Protein Engineering,该文的摘要是该文的摘要是:vThe prospects for protein engineering,including the roles of x-ray crystallography,chemical synthesis of DNA,and computer model
2、ing of protein structure and folding,are discussed.It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis.Such techniques offer the potential for altering protein structure and f
3、unction in ways not possible by any other method.v该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋白质工程该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋白质工程诞生了。诞生了。第2页,此课件共55页哦v蛋白质工程(蛋白质工程(protein engineeringprotein engineering)研究在过)研究在过去的去的2525年间发展迅速,已取得一批较好成果,年间发展迅速,已取得一批较好成果,并开始应用于医学、农业、轻工等各个领域。并开始应用于医学、农业、轻工等各个领域。v20002000年年6 6月月2626日,人类基因组的工作草图宣日,
4、人类基因组的工作草图宣告完成,并进入了后基因组时代(告完成,并进入了后基因组时代(post-post-genome eragenome era)。)。v后基因组时代,中心任务是揭示基因组及其后基因组时代,中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能,并在此基础上阐所包含的全部基因的功能,并在此基础上阐明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、死亡的基本生物学规律,以及与人类健康和死亡的基本生物学规律,以及与人类健康和疾病相关的生物学问题。疾病相关的生物学问题。第3页,此课件共55页哦v由于基因的功能最终是通过其表达产物蛋白由于基因的功能最终是通过其表达产
5、物蛋白质来实现的,因此,在人类基因组测序之后质来实现的,因此,在人类基因组测序之后进一步集中研究蛋白质的结构及功能,是揭进一步集中研究蛋白质的结构及功能,是揭示基因组功能,阐释生命活动规律和生命现示基因组功能,阐释生命活动规律和生命现象本质的基本途径,也是阐释疾病发生与发象本质的基本途径,也是阐释疾病发生与发展的分子机理并进而战胜疾病的重要途径。展的分子机理并进而战胜疾病的重要途径。v研究蛋白质的结构和功能,继而人工改造蛋研究蛋白质的结构和功能,继而人工改造蛋白质的结构,并获得我们所需要的活性蛋白白质的结构,并获得我们所需要的活性蛋白质,正是蛋白质工程的主要任务和目标质,正是蛋白质工程的主要任
6、务和目标。第4页,此课件共55页哦一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念 Protein Engineeringv蛋白质工程是在重组蛋白质工程是在重组DNA技术应用于蛋白质技术应用于蛋白质结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。科。v所谓蛋白质工程,就是通过对蛋白质已知结所谓蛋白质工程,就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解,借助计算机辅助设计,利构和功能的了解,借助计算机辅助设计,利用基因定点诱变等技术,特异性地对蛋白质用基因定点诱变等技术,特异性地对蛋白质结构基因进行改造,产生具有新的特性的蛋结构基因进行改造,产生具有新的特性的蛋白质的技术,并由此深
7、入研究蛋白质的结构白质的技术,并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。与功能的关系。第5页,此课件共55页哦v蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础上,融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计上,融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发展起来的一个新兴研究领域,它开创了按照展起来的一个新兴研究领域,它开创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期,因此,被誉为第二代遗传工程。新时期,因此,被誉为第二代遗传工程。v蛋白质工程的出现,为认识和改造蛋白质
8、分蛋白质工程的出现,为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。子提供了强有力的手段。第6页,此课件共55页哦二、蛋白质工程的理论基础二、蛋白质工程的理论基础v(一)工、农业以及医药卫生事业的高速发(一)工、农业以及医药卫生事业的高速发 展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v(二)蛋白质结构与功能关系研究技术的建(二)蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究,从立推动了蛋白质结构与功能关系的研究,从而为蛋白质改造提供了理论依据而为蛋白质改造提供了理论依据v(三)基因工程理论和技术的发展,为蛋白(三)基因工程理论和技术的发展,为蛋白
9、质的改造和生产提供了必要的技术手段质的改造和生产提供了必要的技术手段第7页,此课件共55页哦(一)工、农业以及医药卫生事业的高速发展(一)工、农业以及医药卫生事业的高速发展 为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v1.1.酶的开发利用依赖于蛋白质工程的研发酶的开发利用依赖于蛋白质工程的研发v酶的专一性强,在温和条件下能有效地催化酶的专一性强,在温和条件下能有效地催化化学反应,使酶的应用日益广泛。药品、化化学反应,使酶的应用日益广泛。药品、化学、食品工业及分析服务行业是酶开发的重学、食品工业及分析服务行业是酶开发的重要领地。要领地。v加酶去污剂加酶去污剂:洗衣粉
10、、漂白分等;洗衣粉、漂白分等;v医药:医药:Streptokinase(链激酶链激酶)、urokinase(尿激酶尿激酶)、TPA(组织型纤溶酶原激活剂)等。组织型纤溶酶原激活剂)等。第8页,此课件共55页哦v妨碍酶开发利用的原因主要有:妨碍酶开发利用的原因主要有:v生物材料中酶含量甚少,用传统方法分离纯化酶蛋白生物材料中酶含量甚少,用传统方法分离纯化酶蛋白成本太高;成本太高;v酶蛋白分子结构的稳定性差,过酸、过碱、高温、氧化等酶蛋白分子结构的稳定性差,过酸、过碱、高温、氧化等因素可破坏其结构,使其丧失生物活性,因而在工业加工因素可破坏其结构,使其丧失生物活性,因而在工业加工条件下,酶的半衰期
11、短,利用率低;条件下,酶的半衰期短,利用率低;v酶催化活性的最适酶催化活性的最适pH值及底物专一性的范围较窄,与值及底物专一性的范围较窄,与工业应用的要求有较大差距。工业应用的要求有较大差距。v因此,要想扩大酶蛋白的开发利用,需要建立适当的方法,因此,要想扩大酶蛋白的开发利用,需要建立适当的方法,以改善酶蛋白的生物特性,使之适合于工业应用的需求,这以改善酶蛋白的生物特性,使之适合于工业应用的需求,这就需要利用蛋白质工程对蛋白质进行改造。就需要利用蛋白质工程对蛋白质进行改造。第9页,此课件共55页哦v如加酶洗衣粉就是在洗衣粉中加入一种蛋白如加酶洗衣粉就是在洗衣粉中加入一种蛋白水解酶枯草杆菌蛋白酶
12、水解酶枯草杆菌蛋白酶,提高洗衣粉的洗涤效提高洗衣粉的洗涤效果果.但是但是,由于其稳定性较差由于其稳定性较差,最适最适pHpH值和最适值和最适温度较窄温度较窄,在洗衣机中洗衣服时效果较差在洗衣机中洗衣服时效果较差.经蛋经蛋白质工程改造后大大提高了其应用价值白质工程改造后大大提高了其应用价值,现已现已成为加酶洗衣粉的重要成分成为加酶洗衣粉的重要成分.第10页,此课件共55页哦v2.2.在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的基础与应用研究中,同样存在着蛋白质结构基础与应用研究中,同样存在着蛋白质结构的改造问题的改造问题v如白细胞介素如白细胞介素-2-2(IL-2-2
13、)是一种免疫反应调)是一种免疫反应调节因子,在医学上具有广泛的用途。结构研节因子,在医学上具有广泛的用途。结构研究证明,究证明,IL-2-2是由是由133133个氨基酸残基组成的多个氨基酸残基组成的多肽,有肽,有3 3个半胱氨酸,个半胱氨酸,1 1个二硫键,而个二硫键,而125125位上位上的半胱氨酸处于游离状态的半胱氨酸处于游离状态,在分离纯化,在分离纯化IL-2IL-2的的过程中,易发生二硫键错配,致使整个多肽过程中,易发生二硫键错配,致使整个多肽活性降低。活性降低。v定点诱变将编码链上编码定点诱变将编码链上编码125125位半胱氨酸的密位半胱氨酸的密码子码子TGT转换成丝氨酸或丙氨酸的密
14、码转换成丝氨酸或丙氨酸的密码(TCT或或GCA),结果可以避免二硫键的错配,使产,结果可以避免二硫键的错配,使产品品IL-2的活性的活性提高了提高了7 7倍倍。第11页,此课件共55页哦v再如再如:单克隆抗体是很有希望的疾病治疗用药单克隆抗体是很有希望的疾病治疗用药,但是但是,单克隆抗体技术建立起已有数十年单克隆抗体技术建立起已有数十年,并早并早已认识到其药用价值已认识到其药用价值,但至今应用不佳但至今应用不佳,原因是原因是鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源化改鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源化改造需蛋白质工程才能完成。造需蛋白质工程才能完成。v可见,改造蛋白质的空间结构以改变蛋白质可见,改
15、造蛋白质的空间结构以改变蛋白质的某些生物学特性,在拓宽蛋白质的用途,的某些生物学特性,在拓宽蛋白质的用途,推动生物技术产业化方面至关重要。而蛋白推动生物技术产业化方面至关重要。而蛋白质精细结构的改造,只有利用蛋白质工程技质精细结构的改造,只有利用蛋白质工程技术才能得以实现。术才能得以实现。第12页,此课件共55页哦(二)蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动(二)蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究,从而为蛋白质改了蛋白质结构与功能关系的研究,从而为蛋白质改造提供了理论依据造提供了理论依据v蛋白质工程的重要目标之一,是通过改造蛋白质的结构蛋白质工程的重要目标之一,
16、是通过改造蛋白质的结构来提高其开发利用的价值。这就是说,蛋白质的结构改来提高其开发利用的价值。这就是说,蛋白质的结构改变了,其生物学功能不能变。变了,其生物学功能不能变。v研究表明,蛋白质功能部位的几个氨基酸残基决定着蛋白质研究表明,蛋白质功能部位的几个氨基酸残基决定着蛋白质的功能,但是这几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极的功能,但是这几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极其精密的空间状态下才能发挥功能。只有能维持蛋白质结构其精密的空间状态下才能发挥功能。只有能维持蛋白质结构域的必须氨基酸及其空间构象不变,其功能域的生物学活性域的必须氨基酸及其空间构象不变,其功能域的生物学活性才会保持不变
17、。才会保持不变。第13页,此课件共55页哦第14页,此课件共55页哦第15页,此课件共55页哦v因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能的因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能的关系进行充分地研究,了解影响蛋白质特性的氨基酸关系进行充分地研究,了解影响蛋白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些?改变这个(些)氨基酸是否会或氨基酸序列是哪些?改变这个(些)氨基酸是否会影响蛋白质的功能?影响蛋白质的功能?v阐明蛋白质的三维结构,进而研究其与生物学功能的阐明蛋白质的三维结构,进而研究其与生物学功能的关系已成为了解生命现象的关键,并成为蛋白质工程关系已成为了解生命现象的关键,并成为蛋白质工程的基础
18、。的基础。v蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等。蛋白质动力学、生物信息学等。第16页,此课件共55页哦v1蛋白质晶体学蛋白质晶体学v蛋白质晶体学(蛋白质晶体学(protein crystallography)是)是利用利用X射线衍射法(射线衍射法(X-ray diffraction method)的原理解释蛋白质晶体中的原子在)的原理解释蛋白质晶体中的原子在空间的位置与排列,并了解其与功能的关系。空间的位置与排列,并了解其与功能的关系。v2020世纪世纪5050年代末用年代末用X射线晶体学方法测定了射线
19、晶体学方法测定了第一个蛋白质第一个蛋白质肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构.v现已有现已有400400多种蛋白质的三维结构被揭示。多种蛋白质的三维结构被揭示。v通过蛋白质三维结构的研究有助于了解蛋白通过蛋白质三维结构的研究有助于了解蛋白质是如何发挥生物学功能的。质是如何发挥生物学功能的。第17页,此课件共55页哦v近年来又发展了近年来又发展了核磁共振(核磁共振(NMR)技术)技术,它,它是确定蛋白质分子在溶液中结构信息广为使是确定蛋白质分子在溶液中结构信息广为使用的方法。核磁共振技术使用较低强度辐射用的方法。核磁共振技术使用较低强度辐射能测定蛋白质分子在流动化液态下的三维结能测定蛋白质分子在流动化液
20、态下的三维结构信息,从而更真实地反映蛋白质在生物环构信息,从而更真实地反映蛋白质在生物环境下的结构信息,并能确定小分子与大分子境下的结构信息,并能确定小分子与大分子复合物的结构。复合物的结构。第18页,此课件共55页哦v2蛋白质动力学蛋白质动力学v线性多肽是如何折叠成具有三维特征的天然结构?蛋白线性多肽是如何折叠成具有三维特征的天然结构?蛋白质在与其他物质(蛋白质、核酸或酶的底物等)相互作质在与其他物质(蛋白质、核酸或酶的底物等)相互作用时,其三维结构又是经历怎样的动态过程而发挥其活用时,其三维结构又是经历怎样的动态过程而发挥其活性?只有了解这些问题,才能预测基因水平的改造最终性?只有了解这些
21、问题,才能预测基因水平的改造最终会对蛋白质结构与功能产生何种后果,才能谈得上具有会对蛋白质结构与功能产生何种后果,才能谈得上具有真正意义的分子设计,才能真正的理解生命现象。蛋白真正意义的分子设计,才能真正的理解生命现象。蛋白质动力学正是研究这一课题的。质动力学正是研究这一课题的。第19页,此课件共55页哦v3.生物信息学生物信息学v生物信息学生物信息学的神速发展为蛋白质动力学的研究提供了的神速发展为蛋白质动力学的研究提供了方便有效的技术。方便有效的技术。v生物信息学是利用计算机控制的生物信息学是利用计算机控制的图像显示系统图像显示系统,把所要,把所要研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上,分析哪
22、些残基对研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上,分析哪些残基对分子内分子内相互作用可能是重要的,哪些残基对相互作用可能是重要的,哪些残基对分子间分子间相互相互作用可能是重要的。前者通常为结构的稳定所必需,作用可能是重要的。前者通常为结构的稳定所必需,后者多系分子识别及活性重要部位。后者多系分子识别及活性重要部位。v然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团,再用计算然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团,再用计算机寻找经过机寻找经过“微扰微扰”后蛋白质分子的能量趋于极小的状态,后蛋白质分子的能量趋于极小的状态,预测由于这种替换可能造成的后果。预测由于这种替换可能造成的后果。v生物信息学是蛋白质工
23、程研究必不可少的。目前已有蛋白生物信息学是蛋白质工程研究必不可少的。目前已有蛋白质结构与特性分析所需的生物信息数据库,可供选择。质结构与特性分析所需的生物信息数据库,可供选择。第20页,此课件共55页哦(三)基因工程理论和技术的发展,为蛋(三)基因工程理论和技术的发展,为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段白质的改造和生产提供了必要的技术手段v1.基因克隆、表达与纯化技术的成熟为提高基因克隆、表达与纯化技术的成熟为提高蛋白质得率提供了重要技术策略蛋白质得率提供了重要技术策略v随着基因工程理论和技术的发展,人们已经随着基因工程理论和技术的发展,人们已经能克隆特异蛋白质的基因,并令其在适宜宿能克
24、隆特异蛋白质的基因,并令其在适宜宿主菌中表达,使蛋白质的产量大大提高,因主菌中表达,使蛋白质的产量大大提高,因而降低蛋白质纯化成本的问题已基本解决。而降低蛋白质纯化成本的问题已基本解决。重要的问题是提高酶蛋白的稳定性,改良其重要的问题是提高酶蛋白的稳定性,改良其生物学特性。生物学特性。第21页,此课件共55页哦v2.2.定点诱变技术的建立定点诱变技术的建立为改造蛋白质的特性为改造蛋白质的特性提供了技术策略提供了技术策略v稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用,如互作用,如肽键、氢键、静电作用、肽键、氢键、静电作用、疏水
25、残基间的疏水残基间的疏水键疏水键以及以及二二硫键硫键等。等。v研究表明,上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构研究表明,上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的,人工改变或修饰这些氨基中某一个或某一段氨基酸序列决定的,人工改变或修饰这些氨基酸残基,有可能增加蛋白质的稳定性,又不影响其生物学活性。酸残基,有可能增加蛋白质的稳定性,又不影响其生物学活性。第22页,此课件共55页哦v如野生型枯草杆菌蛋白酶的如野生型枯草杆菌蛋白酶的218218位天冬酰胺位天冬酰胺(Asn)(Asn)是酶活性部位有关的氨基酸残基,若将是酶活性部位有关的氨基酸残基,若将其变成
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