蛋白质工程 课件.ppt
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1、蛋白质工程 第1页,此课件共36页哦要实现蛋白质工程必须由要实现蛋白质工程必须由3 3部分的科学家共同努力才能完成。部分的科学家共同努力才能完成。蛋白质空间结构测定的专家蛋白质空间结构测定的专家;蛋白质分子设计的专家蛋白质分子设计的专家 基因工程的专家。基因工程的专家。第2页,此课件共36页哦空间结构测定的专家空间结构测定的专家:主要应用主要应用X X射线晶体结构分析的方法与技术对蛋射线晶体结构分析的方法与技术对蛋白质分子的空间结构进行实验测定。白质分子的空间结构进行实验测定。多多维维核磁共振技核磁共振技术术和和电电子衍射子衍射等等电电子晶体学的技子晶体学的技术术已用来确定生物大分已用来确定生
2、物大分子的子的结结构和溶液构象。构和溶液构象。确定哪些特征结构决定了它们的生物功能,从而发现结构与功能相关的规律。确定哪些特征结构决定了它们的生物功能,从而发现结构与功能相关的规律。蛋白质的哪些部分比较脆弱,蛋白质的哪些部分比较脆弱,哪些部分比较牢固,哪些部分比较牢固,哪些部分比较坚硬,哪些部分比较坚硬,哪些部分比较柔软,哪些部分比较柔软,哪些部分可以引起人们不希望的毒、副作用,等等。哪些部分可以引起人们不希望的毒、副作用,等等。第3页,此课件共36页哦分子设计的专家分子设计的专家:在了解了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之在了解了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后,主要通过
3、理论的方法,提出蛋白质改性的设计方案。后,主要通过理论的方法,提出蛋白质改性的设计方案。这一方案将提供改性后的蛋白质哪些部分的氨基酸顺序与天然这一方案将提供改性后的蛋白质哪些部分的氨基酸顺序与天然蛋白质不同,这些新的序列可以导致怎样的空间结构和电子结构的蛋白质不同,这些新的序列可以导致怎样的空间结构和电子结构的变化,从而能赋予新蛋白质什么样的特性。变化,从而能赋予新蛋白质什么样的特性。当前的分子设计主要以能显示图形图象的计算机为工具,采用当前的分子设计主要以能显示图形图象的计算机为工具,采用基基于物理学原理的各种模拟方法于物理学原理的各种模拟方法和和基于蛋白质分子结构知识的模型构建基于蛋白质分
4、子结构知识的模型构建方法方法,或兼用这两类方法。,或兼用这两类方法。第4页,此课件共36页哦基基因因工工程程的的专专家家:在在得得到到了了新新的的蛋蛋白白质质的的改改性性设设计计方方案案之之后后,就就用用一一套套分分子子生生物物学学的的技技术术,先先合合成成相相应应的的基基因因模模板板,再再经经过过克克隆隆与与表表达达,得得到到新新蛋蛋白白质质的的产产物物,最最后后通通过过分分离离、纯纯化化,提提取取出出足足够够纯纯的的新新蛋蛋白白质质以研究它的性质。以研究它的性质。第5页,此课件共36页哦 胰胰岛岛素素是是治治疗疗胰胰岛岛素素依依赖赖型型糖糖尿尿病病的的特特效效药药物物,但但是是天天然然的的
5、胰胰岛岛素素在在人体中的寿命只有几个小时人体中的寿命只有几个小时 要要想想得得到到长长效效的的胰胰岛岛素素,一一个个直直观观的的设设计计思思路路就就是是在在维维持持活活性性部部位位结结构不变的同时,增加其他部位的结合强度,使之更难以被酶所破坏。构不变的同时,增加其他部位的结合强度,使之更难以被酶所破坏。我我国国科科学学家家实实现现的的一一个个巧巧妙妙的的方方案案就就是是增增加加胰胰岛岛素素多多聚聚体体之之间间的的结结合合强强度,以实现长效的目的。度,以实现长效的目的。(1)胰岛素的蛋白质工程胰岛素的蛋白质工程第6页,此课件共36页哦 核糖体失活蛋白核糖体失活蛋白 除除有有引引产产作作用用外外,
6、也也能能抑抑制制肿肿瘤瘤细细胞胞的的生生长长和和艾艾滋滋病病病病毒毒的的复复制。制。但天花粉的毒副作用也很强,很易引起过敏等免疫反应。但天花粉的毒副作用也很强,很易引起过敏等免疫反应。通通过过对对天天花花粉粉晶晶体体结结构构的的分分析析发发现现,它它的的活活性性中中心心部部位位和和引引起起过敏的部位是分离的,这就为天花粉的改性提供了可能。过敏的部位是分离的,这就为天花粉的改性提供了可能。(2)天花粉的蛋白质工程天花粉的蛋白质工程第7页,此课件共36页哦 其其改改型型设设计计方方案案就就是是尽尽量量把把鼠鼠抗抗体体的的氨氨基基酸酸序序列列和和它它的的空空间间结结构构改变成人的。改变成人的。早早在
7、在19881988年年英英国国剑剑桥桥大大学学的的WinterWinter等等人人就就开开展展了了这这方方面面的的工工作作,近近几几年年来来,我我国国科科研研人人员员也也进进行行了了抗抗体体人人源源化化方方面面的的研研究究,并并得得到到有活性的重链单域改性重组抗体。有活性的重链单域改性重组抗体。(3)抗体的人源化抗体的人源化第8页,此课件共36页哦鼠抗体鼠抗体OKT3结合位点结构模拟和改性设计结合位点结构模拟和改性设计决定抗原特异性的主要是决定抗原特异性的主要是互补决定区互补决定区(complementary determined regions,CDRs)第9页,此课件共36页哦在抗体改性的
8、最初阶段,在抗体改性的最初阶段,通通过过基基因因工工程程将将人人的的C区区连连接接到到鼠鼠的的V区区上上,制制出出了了基基因因工工程程抗抗体体,称为称为嵌合抗体嵌合抗体(ChimeriCantibody)。由由于于抗抗体体的的抗抗原原结结合合位位点点位位于于V区区内内,因因此此嵌嵌合合抗抗体体仍仍保保留留了了结结合合抗抗原原的的能能力力,同同时时,由由于于C区区已已替替换换成成为为人人的的,这这就就在在一一定定程程度度上上解解决决了了异异源源抗抗体体问问题题。但但由由于于嵌嵌合合抗抗体体的的V区区全全来来自自鼠鼠,仍仍然然有有可可能能引引起起宿宿主主的过敏反应,所以它不是好的抗体改性产物。的过
9、敏反应,所以它不是好的抗体改性产物。第10页,此课件共36页哦 一种方案就是仅用鼠的一种方案就是仅用鼠的CDRs代替人的代替人的CDRs,V区的其他部分均选区的其他部分均选用人的。用人的。原则上,这种改性能够保持亲代鼠抗体的抗原特异性,又能更大原则上,这种改性能够保持亲代鼠抗体的抗原特异性,又能更大程度地消除宿主免疫反应。这样的抗体比嵌合抗体更接近人的抗体,程度地消除宿主免疫反应。这样的抗体比嵌合抗体更接近人的抗体,故称为故称为人源化抗体人源化抗体或或改型抗体改型抗体(reshapedantibody)。第一个按此方案进行的第一个按此方案进行的人源化抗体人源化抗体的亲和力却仅为原来鼠抗的亲和力
10、却仅为原来鼠抗体的亲和力的体的亲和力的1/40。第11页,此课件共36页哦 经仔细分析鼠抗体经仔细分析鼠抗体V区的序列,尤其是位于区的序列,尤其是位于CDRs邻近处的序列,以及邻近处的序列,以及相应的空间结构,发现相应的空间结构,发现邻近邻近CDRs的残基对于抗体的的残基对于抗体的CDRS与抗原的结合与抗原的结合也起到重要的作用也起到重要的作用,因此必须在人源化方案中加以考虑。,因此必须在人源化方案中加以考虑。根根据据这这一一思思想想,研研究究者者对对T淋淋巴巴细细胞胞膜膜抗抗原原(CD3)的的鼠鼠抗抗体体OKT3的的可可变变区区(V区区)进进行行了了人人源源化化设设计计,在在模模拟拟了了OK
11、T3空空间间结结构构的的基基础础上上,又又构构建建了了人人源源化化的的OKT3的的空空间间结结构构,并并比比较较了了改改型型设设计计对对CDRs构构象象的的影影响响。研研究究结结果果表表明明,人人源源化化过过程程并并没没有有使使CDRs的的构构象象产产生生较较大大的的改改变变,因因而而改改型型抗抗体体应应保保持持原原有有活活力力。按按此此方方案案经经基基因因工工程程技技术术生生产产的的单单域域抗抗体体确确实具有活性。这一实验结果说明,抗体的人源化是可行的。实具有活性。这一实验结果说明,抗体的人源化是可行的。第12页,此课件共36页哦像凝乳酶像凝乳酶枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶葡萄糖异构酶、葡萄
12、糖异构酶、胰蛋白酶胰蛋白酶等的研究等的研究 都取得了明显进展。都取得了明显进展。与乳制品的生产有关与乳制品的生产有关是洗涤剂的添加剂,用于清除蛋白质的污渍等。是洗涤剂的添加剂,用于清除蛋白质的污渍等。第13页,此课件共36页哦二、蛋白质工程领域的开创性工作二、蛋白质工程领域的开创性工作 早早在在1987年年美美国国杜杜邦邦公公司司的的DeGrado等等人人就就利利用用当当时时已已积积累累的的蛋蛋白白质质分分子子空空间间结结构构与与构构象象的的规规律律,经经过过精精心心的的设设计计并并由由多多肽肽合合成成法法产产生生出出了了一一个个由由74个个氨氨基基酸酸组组成成的的非非天天然然蛋蛋白白质质。它
13、它具具有有设设计计者者所所期期望望的的典典型型的的4股股 螺螺旋旋结结构构。这这一一工工作作被被称称为为蛋蛋白白质质分分子子设设计计的的第第一一个个里里程程碑。碑。紧紧接接着着Duke大大学学的的Richardson夫夫妇妇经经过过从从头头设设计计并并用用基基因因工工程程的的方方法法不不仅仅合合成成了了另另一一种种4股股螺螺旋旋的的非非天天然然蛋蛋白白质质,还还合合成成了了全全 折折叠叠结构的,称为结构的,称为betabellin的非天然蛋白质。的非天然蛋白质。此此后后的的一一系系列列从从头头设设计计(De novo)的的实实验验结结果果说说明明,定定向向地地设设计计与与合合成成具具有有人人们
14、们所所要要求求的的空空间间结结构构与与性性质质的的蛋蛋白白质质是是合合理理的的、可可行行的的。此此后后对对分分子子量量较较小小的的各各种种类类型型药药物物的的设设计计、研研究究与与生生产产也也蓬蓬勃勃地地开开展展起起来来。并并有有若若干干个成功的例子。个成功的例子。第14页,此课件共36页哦艾滋病毒艾滋病毒HIVHIV蛋白水解酶抑制剂的设计。蛋白水解酶抑制剂的设计。HIV-lHIV-l蛋蛋白白水水解解酶酶是是由由两两个个含含有有9999个个氨氨基基酸酸残残基基的的单单体体组组成成的的天天冬冬氨氨酸酸水水解解酶酶,它它在在将将艾艾滋滋病病毒毒导导入入人人体体细细胞胞过过程程中中起起了了重重要要作
15、作用用。高高效效的该酶抑制剂将是治疗艾滋病的有前途的药物。的该酶抑制剂将是治疗艾滋病的有前途的药物。两两个个大大的的制制药药厂厂Abbott(ChicagoAbbott(Chicago,ILIL,USA)USA)和和DuPont DuPont Merck(GlenoldenMerck(Glenolden,PAPA,USA)USA)分分别别使使用用计计算算机机辅辅助助设设计计合合成成了了具具有有对对称称性性的的,口口服服有有效效的的HIVHIV蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂。剂。DuPont MerCkDuPont MerCk的产品的产品DMP323DMP323正在进行临床试验。正在进行临床试验。第15
16、页,此课件共36页哦 胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂:它是由它是由AgouronAgouron药厂药厂(La Jolla(La Jolla,CACA,USA)USA)基于该酶活性中心区结构基于该酶活性中心区结构的知识设计的。作为一个抗肿瘤药物目前正在临床试用的知识设计的。作为一个抗肿瘤药物目前正在临床试用 凝血酶抑制剂的设计,凝血酶抑制剂的设计,高血压蛋白酶原抑制剂的设计高血压蛋白酶原抑制剂的设计 当前蛋白质工程研究的热点主要集中在两个方面当前蛋白质工程研究的热点主要集中在两个方面:一方面是一方面是:对具有明显生物功能的天然蛋白质分子,加以改性对具有明显生物功能的天然蛋白
17、质分子,加以改性;另一方面另一方面:是基于生物大分子结构知识的药物设子是基于生物大分子结构知识的药物设子.第16页,此课件共36页哦三、蛋白质的改性及分子设计三、蛋白质的改性及分子设计当前蛋白质工程研究的热点之一当前蛋白质工程研究的热点之一到到19991999年年2 2月月3 3日,在日,在PDB(protein data bank,Brookhaven National PDB(protein data bank,Brookhaven National Laboratory)Laboratory)库中收集的生物大分子空间结构数据已达库中收集的生物大分子空间结构数据已达92269226套,套,
18、其中蛋白质结构其中蛋白质结构85688568套,套,核酸结构核酸结构646646套,套,糖类结构糖类结构1212套。套。这就使得基于蛋白质和核酸结构上的药物设计成为可能。这就使得基于蛋白质和核酸结构上的药物设计成为可能。这这是是因因为为任任何何药药物物都都是是作作用用在在相相应应的的受受体体上上的的,这这些些受受体体或或靶靶分分子子往往往往又又是是蛋蛋白白质质或或核核酸酸。如如果果我我们们有有了了这这些些大大分分子子的的结结构构,就就容容易易发发现现哪哪些些物物质质能能与与这这些些受受体体发发生生特特定定的的结结合合,使使得得药药物物的的筛筛选选与与设设计计有有了了科科学学依依据据,避避免免了
19、了盲盲目目性性。这这就就是是基基于于生生物物大大分分子子结结构构知识的药物设计。知识的药物设计。第17页,此课件共36页哦选择蛋白质工程改造对象时往往要考虑以下几个方面选择蛋白质工程改造对象时往往要考虑以下几个方面:(1)改性对象有没有测定出空间结构。改性对象有没有测定出空间结构。(2)结构和生物功能的联系是否明确。结构和生物功能的联系是否明确。(3)所选对象的重要性。所选对象的重要性。(4)是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子 它的生物学作用是抑制肿瘤血管的形成。因此就可有效地抑制肿瘤。它的生物学作用是抑制肿瘤血管的形成
20、。因此就可有效地抑制肿瘤。但但是是研研究究还还发发现现,肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子有有很很强强的的毒毒副副作作用用。如如不不能能有有效效地地降降低低其其毒毒副副作作用用,就就不不能能将将其其用用于于肿肿瘤瘤治治疗疗。有有报报道道说说,我我国国科科学学家家己己经经通通过过蛋蛋白白质质工工程程的的技技术术,改改变变了了天天然然肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子的的结结构构,使使其其毒毒性性大大为降低,同时还保留了生物活性。为降低,同时还保留了生物活性。第18页,此课件共36页哦肿瘤细胞区别于正常细胞的基本特征是:肿瘤细胞区别于正常细胞的基本特征是:细胞生长失控和分化受阻细胞生长失控和分化受阻,因此易于恶性生长
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