流式细胞凋亡分析精选PPT.ppt
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1、关于流式细胞凋亡分析第1页,讲稿共106张,创作于星期二概概 念念 细胞凋亡(细胞凋亡(apoptosisapoptosis)是指有核细胞在一)是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制,主要是通过定条件下通过启动其内部自身机制,主要是通过内源性内源性DNADNA内切酶的激活而发生的细胞死亡过内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程,是生物体中一种普遍存在的现胞自杀过程,是生物体中一种普遍存在的现象。象。第2页,讲稿共106张,创作于星期二概概 念念 细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功细胞凋亡是维持人体正常生理过程
2、和功能活动所必需的,是多细胞生物生命活动过能活动所必需的,是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容,是其藉以存活的程中不可缺少的组成内容,是其藉以存活的需要,贯穿了生物全部生命周期中。需要,贯穿了生物全部生命周期中。第3页,讲稿共106张,创作于星期二概概 念念 细胞凋亡与细胞坏死(细胞凋亡与细胞坏死(necrosisnecrosis)是细)是细胞死亡的两种模式,但两者有明显的区别。后者胞死亡的两种模式,但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程,并可导致周围组织作用后发生的被动分解过程,并可导致周围
3、组织的炎症反应。的炎症反应。第4页,讲稿共106张,创作于星期二概概 念念细胞凋亡的作用主要包括以下几方面:细胞凋亡的作用主要包括以下几方面:清除无功能的细胞;清除无功能的细胞;控制细胞数量;控制细胞数量;清除病态的或有害的细胞;清除病态的或有害的细胞;清除多余的细胞;清除多余的细胞;第5页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征:形态学特征:光镜下,凋亡细胞最突出的形态学特征光镜下,凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整,其中胞核变化尤为突出。而细胞膜保持完整,其中胞核变化尤为突出。染
4、色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链DNADNA发生裂解所致。发生裂解所致。第6页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征:形态学特征:DNADNA降解后,形成长度主要为降解后,形成长度主要为180-200bp180-200bp的的DNADNA片断,随后细胞裂解成许多有膜包被的小片断,随后细胞裂解成许多有膜包被的小体,称为凋亡小体(体,称为凋亡小体(apoptotic bodies),apoptotic bodies),最后被最后被巨噬细胞吞噬,但不会引起周围组织的炎症反应。巨噬细胞吞噬,但不会引起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡
5、细胞特征性的标志。如在显微镜凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体,则可确认为细胞发生了凋亡。下观察到凋亡小体,则可确认为细胞发生了凋亡。第7页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征:形态学特征:电镜下,细胞核内可见高电子密度区,这电镜下,细胞核内可见高电子密度区,这是核是核DNADNA在核小体连接处断裂成核小体后,在在核小体连接处断裂成核小体后,在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区,是质聚集区以外的低电子密度区为透明区,是由于核孔变大导致其通透性增加,细胞质中由于核孔
6、变大导致其通透性增加,细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖,呈空泡水分不断渗入而造成。线粒体增殖,呈空泡化。内质网腔扩大,为凋亡细胞形成自噬体化。内质网腔扩大,为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。第8页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征:形态学特征:第9页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征:形态学特征:第10页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征:形态学特征:共聚焦显微镜观察,凋亡细胞膜电位和线共聚焦显微镜观察,凋亡细胞膜电位和线粒体膜电
7、位下降,膜流动性降低。细胞膜上新粒体膜电位下降,膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,ps)phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白和凝血酶敏感蛋白等,这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。等,这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。第11页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征:形态学特征:凋亡细胞另一个形态特征通过总凋亡细胞另一个形态特征通过总DNADNA提取,提取,DNADNA凝胶电泳分析,可呈现出梯状图谱,可见清晰凝胶电泳分析,可呈现出梯状图谱,可见
8、清晰的的DNADNA梯子梯子(ladder)(ladder)。第12页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:1 caspase1 caspase蛋白酶:蛋白酶:细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程,它将大分子结构的物质如级联切割的过程,它将大分子结构的物质如DNADNA、细胞骨架水解变性成小分子碎片,致使细胞发生细胞骨架水解变性成小分子碎片,致使细胞发生凋亡。凋亡。第13页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:1 caspase1 caspase蛋白酶:蛋白酶:
9、其中,半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。其中,半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列,可它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列,可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为称为caspasecaspase。第14页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:1 caspase1 caspase蛋白酶:蛋白酶:caspasecaspase可能在凋亡细胞的形态变化中起了可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导
10、作用。主导作用。CaspaseCaspase通常是以酶原形式存在,通通常是以酶原形式存在,通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶,过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶,活化的活化的caspasecaspase进一步激活其他的进一步激活其他的caspasecaspase前体,前体,形成了级联放大切割过程,裂解重要的大分子物形成了级联放大切割过程,裂解重要的大分子物质,导致凋亡。质,导致凋亡。第15页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:1 caspase1 caspase蛋白酶:蛋白酶:目前已发现目前已发现1515个个caspasecaspase家
11、族成员,分别命名家族成员,分别命名为为caspase-1caspase-11515,并根据其功能特点分成两类,并根据其功能特点分成两类,即启动即启动caspase(caspase-2caspase(caspase-2、8 8、9 9、1010)和效应)和效应caspase(caspase3caspase(caspase3、6 6、7 7)。)。第16页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:1 caspase1 caspase蛋白酶:蛋白酶:启动启动caspasecaspase作用于凋亡信号触发后上游的作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。效应不可逆位点。
12、效应caspasecaspase由启动胱冬肽酶激由启动胱冬肽酶激活,作用于下游的执行位点,裂解细胞成凋亡活,作用于下游的执行位点,裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体,通过线粒体方式执行凋亡的信号。体,通过线粒体方式执行凋亡的信号。bcl-2bcl-2家族成员能调节执行位点的进程。家族成员能调节执行位点的进程。第17页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:1 caspase1 caspase蛋白酶:蛋白酶:caspase-3caspase-3是最重要的指示蛋白酶,为是最重要的指示蛋白酶,为17k
13、D17kD和和12kD12kD亚单位组成的异二聚体。活化的亚单位组成的异二聚体。活化的caspase-caspase-3 3可以蛋白水解切割和激活其他可以蛋白水解切割和激活其他caspasecaspase、相关的、相关的胞质靶位点(细胞因子胞质靶位点(细胞因子1818,CK18)CK18)和细胞核靶位和细胞核靶位点。点。Caspase-3Caspase-3切割切割CK18CK18是凋亡过程中是凋亡过程中caspasecaspase切割发生的早期指示因子。切割发生的早期指示因子。第18页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:2 2 核酸内切酶的激活:核酸内
14、切酶的激活:细胞凋亡时,内源性核酸内切酶被激活,将细胞凋亡时,内源性核酸内切酶被激活,将核小体间连接核小体间连接DNADNA降解,形成长度主要为降解,形成长度主要为180-180-200bp200bp整数倍的寡核苷酸片段,组蛋白和其他核整数倍的寡核苷酸片段,组蛋白和其他核内蛋白质不降解,核基质也不改变。在内蛋白质不降解,核基质也不改变。在DNADNA凝胶凝胶电泳分析中呈现出特征性电泳分析中呈现出特征性“梯状梯状”条带,而细胞条带,而细胞坏死时,坏死时,DNADNA片断大小不一,无片断大小不一,无“梯状梯状”条带出条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种
15、典型的生化特征。的生化特征。第19页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:2 2 核酸内切酶的激活:核酸内切酶的激活:第20页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:3 3 线粒体的变化:线粒体的变化:线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高,膜上巨型通道开放,使子使线粒体通透性升高,膜上巨型通道开放,使线粒体蛋白进入细胞液中,线粒体膜两侧质子不线粒体蛋白进入细胞液中,线粒体膜两侧质子不对称性消失,线粒体膜电位迅速下降,电子传递对称性消失,线粒体膜电位迅速下降,
16、电子传递与呼吸链解偶联。与呼吸链解偶联。第21页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:3 3 线粒体的变化:线粒体的变化:线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的实施。与凋亡密切相关的bcl-2bcl-2家族分布在细胞内家族分布在细胞内膜系统,其中线粒体外膜上分布最多,膜系统,其中线粒体外膜上分布最多,bcl-2bcl-2具有具
17、有抑制线粒体通透性变化的能力,并通过此途径抑抑制线粒体通透性变化的能力,并通过此途径抑制细胞凋亡。制细胞凋亡。第22页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化:的变化:细胞内细胞内CaCa2+2+和和H H+浓度的稳定对维持生命活浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内动至关重要。胞内CaCa2+2+库的释放,胞质库的释放,胞质CaCa2+2+与细与细胞凋亡关系密切。胞外胞凋亡关系密切。胞外CaCa2+2+内流促使胞质内流促使胞质CaCa2+2+持持续升高,作为凋亡信号启动凋亡发生。续升高,作为凋亡信号启动凋
18、亡发生。第23页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化:的变化:此外,此外,CaCa2+2+的释放打破了细胞内结构的稳定,的释放打破了细胞内结构的稳定,使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触,从而触发细胞构正常时不能接触到的基质接触,从而触发细胞凋亡。凋亡。第24页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征:生化特征:4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化:的变化:细胞细胞pHpH的变化可影响细胞
19、凋亡。细胞凋亡的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时伴随胞质时伴随胞质pHpH降低,胞质酸化影响细胞凋亡。降低,胞质酸化影响细胞凋亡。胞质胞质pHpH降低可能与胞质降低可能与胞质CaCa2+2+升高有关。胞质酸升高有关。胞质酸化主要通过激活酸性化主要通过激活酸性DNaseDNase启动细胞凋亡。启动细胞凋亡。pHpH降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。中的作用。第25页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 细胞凋亡受基因的调控,其机制非常复杂。细胞凋亡受基因的调控,其机制非常复杂。凋亡基因可分为两类:凋亡基因可分
20、为两类:1 1诱导基因:野生型诱导基因:野生型p53p53基因、基因、c-mycc-myc、细胞表面、细胞表面抗原基因抗原基因Apo-1(Fas)Apo-1(Fas)等等2 2抑制基因:抑制基因:bcl-2bcl-2、突变型、突变型p53p53基因和基因和rasras基因基因等等 第26页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调,可提高调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调,可提高细胞对凋亡信号的敏感性,促进凋亡发生。抑制细胞对凋亡信号的敏感性,促进凋亡发生。抑
21、制基因蛋白产物表达,可降低细胞对凋亡信号的敏基因蛋白产物表达,可降低细胞对凋亡信号的敏感性,抑制或推迟凋亡。感性,抑制或推迟凋亡。第27页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡,诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡,可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控,维持细可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控,维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时,就会导致胞群体的正常稳定性。当调控失衡时,就会导致疾病,如肿瘤、疾病,如肿瘤、AIDSAIDS、霍奇金淋巴瘤等。、霍奇金淋巴瘤等。第28页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因
22、调控常见的凋亡基因及其蛋白:常见的凋亡基因及其蛋白:1 bcl-2 1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。是研究最早的与凋亡有关的基因。bcl-2bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径,而对的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径,而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子,如细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子,如化疗药物、某些病毒、化疗药物、某些病毒、p53p53、c-mycc-myc及生长因子及生长因子等激发的凋亡。等激发的凋亡。第29页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控
23、常见的凋亡基因及其蛋白:常见的凋亡基因及其蛋白:2 p53 p532 p53 p53基因不仅是一种与肿瘤发生、发展基因不仅是一种与肿瘤发生、发展相关的抑癌基因,而且参与细胞生长、分化相关的抑癌基因,而且参与细胞生长、分化及死亡的调控。及死亡的调控。P53P53在调节凋亡中起重要作用。在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或gammagamma射线照射线照射后,含正常射后,含正常p53p53的细胞,可发生凋亡,而的细胞,可发生凋亡,而p53p53基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。野生型和化
24、疗药物的抗性。野生型p53p53对凋亡起促进对凋亡起促进作用,突变型作用,突变型p53p53对凋亡起抑制作用。对凋亡起抑制作用。第30页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白:常见的凋亡基因及其蛋白:3 Fas3 Fas和和FasFas配体配体 FasFas是肿瘤坏死因子(是肿瘤坏死因子(TNFTNF)受)受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。FasFas配体(配体(Fas ligand,FasL)Fas ligand,FasL)是是TNFTNF家族的细胞表家族的细胞表面分子。面分子。FasLFasL
25、与其受体与其受体FasFas结合导致携带结合导致携带FasFas的的细胞凋亡。抗细胞凋亡。抗FasFas抗体、表达抗体、表达FasLFasL的细胞和可溶的细胞和可溶性的性的FasLFasL与与FasFas交联均产生细胞凋亡信息,而交联均产生细胞凋亡信息,而bcl-2bcl-2过度表达能抑制过度表达能抑制FasFas致凋亡作用。致凋亡作用。第31页,讲稿共106张,创作于星期二细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤:细胞凋亡与肿瘤:以往,细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊以往,细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来,人们认乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来,人们认识
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