《氨基酸自动分析仪》PPT课件.ppt
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1、第三十八章第三十八章 氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪概述n n实质:高效液相色谱仪n n填料:强酸型阳离子交换树脂n n检测器:可见或荧光分光光度计选择性好、准确度高分析速度快,灵敏度高概述n n20世纪40年代,开始探求色谱法分析氨基酸;n n提高洗脱流速、改良柱直径、填料粒度,提高分析速度;n n20世纪80年代,键合反相分配色谱、柱前衍生技术的发展;n n目前,配合微机控制程序和处理数据,成为氨基酸最准确可靠的分离测试方法。概述n n本章主要内容1、传统离子交换色谱专用氨基酸分析仪2、柱前衍生反相高效液相色谱的氨基酸分析第一节 基本原理n n先将氨基酸混合物在离子交换树脂柱上进行分离,
2、然后按照分离后的氨基酸衍生。根据衍生产物的特性,选择适当的检测器检测并进行定性与定量分析。1.1 离子交换树脂1.填料:磺酸型强酸阳离子交换树脂2.苯乙烯为主体;3.离子交换的活性基团:磺酸根(连接在苯乙烯中乙烯基的对位上);4.与二乙烯基苯交联,形成不溶的高分子骨架,易吸水溶解。5.交联剂所占比例决定网状结构的孔径大小(氨基酸:8%12%的交联度)。6.Na+型(蛋白质水解液中的氨基酸分析),Li+型(全部氨基酸的分析)7、考虑磺化程度、交联剂纯度和类型、粒度大小(510um)。1.2 氨基酸在色谱柱中的分离XO3-Na+H3N+CHRCOOHXSO3-H3N+CHRCOOH +Na+PH减
3、小PH增大PH小于氨基酸的等电点时,氨基酸带正电荷,可被磺酸基团吸引,随着PH升高或离子强度增大,氨基酸所带正电荷减少,吸引力下降乃至消失而被洗脱下来。1 1、不同的氨基酸,其等电点、极性及、不同的氨基酸,其等电点、极性及相对分子质量大小不同,其洗脱顺序相对分子质量大小不同,其洗脱顺序不同;不同;2 2、一般先后顺序:、一般先后顺序:酸性和带羟基的氨基酸(最早)酸性和带羟基的氨基酸(最早)中性氨基酸(其次)中性氨基酸(其次)碱性氨基酸(最后)碱性氨基酸(最后)3 3、同类氨基酸中,短链氨基酸先被洗、同类氨基酸中,短链氨基酸先被洗脱;脱;4 4、碳数相同的氨基酸,有支链的比无、碳数相同的氨基酸,
4、有支链的比无支链的先洗脱出来。支链的先洗脱出来。1.2 氨基酸在色谱柱中的分离n n氨基酸的分离影响因素:离子交换树脂的型号、粒度、交联度;柱长、直径、柱温;洗脱液的阳离子类型、PH值、离子强度、洗脱梯度、流速及其中有机溶剂含量。1.2 氨基酸在色谱柱中的分离1、3 衍生及检测n n多数氨基酸无生色基团,在紫外可多数氨基酸无生色基团,在紫外可见光区无吸收(见光区无吸收(PhePhe、TrpTrp、LyrLyr例例外),需要将它们衍生,成为具有外),需要将它们衍生,成为具有紫外、可见光吸收或能产生荧光的紫外、可见光吸收或能产生荧光的物质才可以检测。物质才可以检测。衍生方式:衍生方式:1、柱前衍生
5、法:、柱前衍生法:将将AA混合物先衍生后,在用反相混合物先衍生后,在用反相 分配分配色谱法分离,测定其紫外吸收或产生的色谱法分离,测定其紫外吸收或产生的荧光强度。荧光强度。1、3 衍生及检测2、柱后衍生法:、柱后衍生法:将将AA混合物用离子交换色谱法分离,在混合物用离子交换色谱法分离,在把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收或产生荧光的物质,然后测定。或产生荧光的物质,然后测定。n n常用的衍生方法:1、3 衍生及检测(1)茚三酮法)茚三酮法多数氨基酸与水合茚三酮在弱酸条件下共多数氨基酸与水合茚三酮在弱酸条件下共热,引起热,引起AA的氧化脱氨、脱羧反应,水的氧化脱
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