益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响.ppt
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1、益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望主要内容主要内容研究背景研究背景1材料与方法材料与方法2结结 果果3讨讨 论论42研究背景研究背景心肌缝隙连接蛋白心肌缝隙连接蛋白4343心肌细胞凋亡心肌细胞凋亡n心血管系统疾病是危害人类心血管系统疾病是危害人类健康的常见病。心肌缝隙连健康的常见病。心肌缝隙连接蛋白接蛋白4343和细胞凋亡的异常和细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病过程中在心血管疾病的发病过程中都
2、扮演了重要角色。都扮演了重要角色。3心肌缝隙连接蛋白心肌缝隙连接蛋白43(CX43)n缝隙连接是一种特殊膜结构,由两个连接子对接而成,缝隙连接是一种特殊膜结构,由两个连接子对接而成,每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白,直接每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白,直接连接两个细胞的胞质,允许相邻细胞间电信号和化学连接两个细胞的胞质,允许相邻细胞间电信号和化学信号的直接通讯。连接蛋白家族有信号的直接通讯。连接蛋白家族有20多个成员,就心多个成员,就心室而言,表达最丰富的是室而言,表达最丰富的是Cx43。4Cx43是维持心肌细胞间化学偶联和电偶连的关键结构是维持心肌细胞间化学偶联和电偶连的关
3、键结构 n心肌缺血时,心肌缺血时,Cx43分分布和表达异常会导致心布和表达异常会导致心肌细胞电偶联的缺失,肌细胞电偶联的缺失,易于发生室性心律失常易于发生室性心律失常甚至猝死甚至猝死。n并且并且Cx43的异常还会的异常还会导致心肌细胞间的代谢导致心肌细胞间的代谢障碍。障碍。5心肌细胞凋亡心肌细胞凋亡n细胞凋亡又称程序性细胞死亡,细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是一种生理现象,但病理状态是一种生理现象,但病理状态下细胞凋亡的增加与心肌缺血、下细胞凋亡的增加与心肌缺血、缺血再灌注损伤和心力衰竭的缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生都密切相关。发生都密切相关。n过度的细胞凋亡会加速心过度的细胞凋亡会加速心肌细
4、胞的丢失,造成心功肌细胞的丢失,造成心功能的恶化,并促进心室重能的恶化,并促进心室重构的发生和发展。构的发生和发展。6材料与方法材料与方法7实验材料实验材料n实验动物实验动物n雄性雄性SD大鼠,体重大鼠,体重200240g,许可号:,许可号:SCXK(京)(京)2006-0009。n实验细胞实验细胞nRat H9C2心肌细胞系(心肌细胞系(ATCC Number:CRL-1446)n实验用药实验用药n生脉注射液(红参、麦冬、五味子),生脉注射液(红参、麦冬、五味子),10ml/支,雅安三九药业有限公支,雅安三九药业有限公司(批号:司(批号:100301)n血塞通注射液(三七总皂苷),血塞通注射
5、液(三七总皂苷),250mg/10ml/支,昆明制药集团股份支,昆明制药集团股份有限公司(批号:有限公司(批号:10DL04)。)。n主要试剂主要试剂n兔抗兔抗Cx43多克隆抗体(批号:多克隆抗体(批号:10440704)nHoechst凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒(#C1100)8实验方法实验方法9整体实验分组与给药方法整体实验分组与给药方法n大鼠随机分为:大鼠随机分为:n益气活血组:生脉注射液联合血塞通注射液益气活血组:生脉注射液联合血塞通注射液n卡托普利组:卡托普利卡托普利组:卡托普利n模型组:生理盐水模型组:生理盐水n假手术组:生理盐水假手术组:生理盐水
6、n连续给药一个月连续给药一个月 10心肌梗死大鼠模型制备心肌梗死大鼠模型制备 参照文献,采用参照文献,采用冠脉结扎法制作冠脉结扎法制作大鼠心肌梗死模大鼠心肌梗死模型。型。王硕仁王硕仁,王振涛王振涛,赵明镜赵明镜,李敏李敏.心气虚病证动物模型心气虚病证动物模型及其评价体系的构建及其评价体系的构建.中国中国实验动物学报实验动物学报.2002;10(1):.2002;10(1):33-38.33-38.11心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价结扎冠脉前结扎冠脉前 结扎冠脉后结扎冠脉后模型组模型组 心功能比较心功能比较n采用心电图和心脏采用心电图和心脏超声评价心梗大鼠超声评
7、价心梗大鼠造模是否成功。造模是否成功。n术后与术前比较,术后与术前比较,大鼠心电图大鼠心电图ST段明段明显抬高。显抬高。n取材前超声检查显取材前超声检查显示模型大鼠左心室示模型大鼠左心室内径明显扩大,室内径明显扩大,室壁变薄,收缩运动壁变薄,收缩运动减弱,心功能降低。减弱,心功能降低。12在体电刺激诱发室颤实验方法在体电刺激诱发室颤实验方法n参照文献,大鼠麻醉后固定,呼吸机辅助呼吸,开胸参照文献,大鼠麻醉后固定,呼吸机辅助呼吸,开胸暴露心脏,连接刺激电极。暴露心脏,连接刺激电极。n采用程控电刺激诱发室颤,记录室颤阈值。采用程控电刺激诱发室颤,记录室颤阈值。n柴松波柴松波,王硕仁王硕仁,姚立芳姚
8、立芳,等等.参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的研究的研究.中国中药杂志中国中药杂志.2009,34(16):2101-210413细胞实验分组与给药方法细胞实验分组与给药方法n正常对照组正常对照组n模型组模型组n血塞通低剂量组血塞通低剂量组n血塞通高剂量组血塞通高剂量组n细胞实验以大鼠细胞实验以大鼠H9C2心肌细胞系为研究对象,分为两个实验。心肌细胞系为研究对象,分为两个实验。n实验实验1 1:生脉联合血塞通注射液对:生脉联合血塞通注射液对H9C2H9C2细胞细胞Cx43Cx43损伤的影响损伤的影响n实验实验2 2:生脉联合血塞通
9、注射液对:生脉联合血塞通注射液对H9C2H9C2细胞凋亡的影响细胞凋亡的影响n两个实验均分为以下八组两个实验均分为以下八组n生脉低剂量组生脉低剂量组n生脉高剂量组生脉高剂量组n生脉和血塞通低剂量组生脉和血塞通低剂量组n生脉和血塞通高剂量组生脉和血塞通高剂量组14细胞实验细胞实验1 1:诱导:诱导H9C2H9C2细胞细胞Cx43Cx43损伤的方法损伤的方法n参照文献,采用参照文献,采用TPA造成造成Cx43的损伤的损伤。nTPA是一种蛋白激酶是一种蛋白激酶C的激活剂,可以增加的激活剂,可以增加Cx43的磷酸化,从而降低的磷酸化,从而降低Cx43通道的通透性,还能通道的通透性,还能显著地降低缝隙连
10、接的组装,并使显著地降低缝隙连接的组装,并使Cx43失去稳失去稳定性。定性。nLampe PD,TenBroek EM,Burt JM,et al.Phosphorylation of connexin43 on serine368 by protein kinase C regulates gap junctional communicationJ.J Cell Biol,2000,149(7):1503-1512.nLampe PD,Lau AF.The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communicationJ
11、.Int J Biochem Cell Biol,2004,36(7):1171-1186.15细胞实验细胞实验1 1:H9C2H9C2细胞细胞Cx43Cx43检测方法检测方法 n采用免疫细胞化学法检测采用免疫细胞化学法检测Cx43Cx43的表达的表达n主要步骤:用主要步骤:用4%4%多聚甲醛固定细胞多聚甲醛固定细胞15min15min,血清封,血清封闭,滴加闭,滴加1:1001:100稀释一抗稀释一抗44孵育过夜。次日加二孵育过夜。次日加二抗,抗,3737孵育孵育30min30min,DABDAB显色,倒置显微镜拍照显色,倒置显微镜拍照观察。观察。16细胞实验细胞实验2 2:诱导:诱导H9C
12、2H9C2细胞凋亡的方法细胞凋亡的方法n参照文献,参照文献,使用使用AngAng诱导心肌细胞凋亡诱导心肌细胞凋亡。n血管紧张素血管紧张素(AngAng)是一种生物活性物质,可使是一种生物活性物质,可使血管收缩,血压升高,并能够诱导心肌细胞的凋亡。血管收缩,血压升高,并能够诱导心肌细胞的凋亡。n裴兆辉裴兆辉,马虹马虹,朱妙章等朱妙章等.血管紧张素血管紧张素诱导心肌细胞凋亡机制诱导心肌细胞凋亡机制的研究进展的研究进展J.J.心脏杂志心脏杂志,2005,17(5):482-483.,2005,17(5):482-483.17细胞实验细胞实验2 2:H9C2H9C2细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法 n
13、采用采用HoechstHoechst染色法检测细胞凋亡染色法检测细胞凋亡n主要步骤:用主要步骤:用4%4%多聚甲醛固定细胞,多聚甲醛固定细胞,PBSPBS洗涤洗涤1 1次,次,加入加入HoechstHoechst染色液,室温孵育染色液,室温孵育10min10min,吸弃染液,吸弃染液,PBSPBS洗涤洗涤1 1次,倒置荧光显微镜观察拍照,分析凋亡次,倒置荧光显微镜观察拍照,分析凋亡细胞占总细胞数的百分比。细胞占总细胞数的百分比。18统计学方法统计学方法n采用采用SPSS13.0SPSS13.0软件进行统计处理,实验数据以软件进行统计处理,实验数据以均数均数标准差标准差(XX)表示。先进行正态性
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