益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡影响精品课件.pptx
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1、1研究背景心肌缝隙连接蛋白43心肌细胞凋亡n心血管系统疾病是危害人类健康的常见病。心肌缝隙连接蛋白43和细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病过程中都扮演了重要角色。第1页/共42页2心肌缝隙连接蛋白43(CX43)缝隙连接是一种特殊膜结构,由两个连接子对接而成,每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白,直接连接两个细胞的胞质,允许相邻细胞间电信号和化学信号的直接通讯。连接蛋白家族有20多个成员,就心室而言,表达最丰富的是Cx43。第2页/共42页3Cx43是维持心肌细胞间化学偶联和电偶连的关键结构 心肌缺血时,Cx43分布和表达异常会导致心肌细胞电偶联的缺失,易于发生室性心律失常甚至猝死。并且Cx
2、43的异常还会导致心肌细胞间的代谢障碍。第3页/共42页4心肌细胞凋亡细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是一种生理现象,但病理状态下细胞凋亡的增加与心肌缺血、缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生都密切相关。n过度的细胞凋亡会加速心肌细胞的丢失,造成心功能的恶化,并促进心室重构的发生和发展。第4页/共42页5材料与方法第5页/共42页6实验材料实验动物雄性SD大鼠,体重200240g,许可号:SCXK(京)2006-0009。实验细胞Rat H9C2心肌细胞系(ATCC Number:CRL-1446)实验用药生脉注射液(红参、麦冬、五味子),10ml/支,雅安三九药业有限公司(批号:100301)血塞通注
3、射液(三七总皂苷),250mg/10ml/支,昆明制药集团股份有限公司(批号:10DL04)。主要试剂兔抗Cx43多克隆抗体(批号:10440704)Hoechst凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒(#C1100)第6页/共42页7实验方法第7页/共42页8整体实验分组与给药方法大鼠随机分为:益气活血组:生脉注射液联合血塞通注射液卡托普利组:卡托普利模型组:生理盐水假手术组:生理盐水连续给药一个月 第8页/共42页9心肌梗死大鼠模型制备 参照文献,采用冠脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型。王硕仁,王振涛,赵明镜,李敏.心气虚病证动物模型及其评价体系的构建.中国实验动物学报.2002;10(1):33-3
4、8.第9页/共42页10心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价结扎冠脉前 结扎冠脉后模型组 心功能比较n采用心电图和心脏超声评价心梗大鼠造模是否成功。n术后与术前比较,大鼠心电图ST段明显抬高。n取材前超声检查显示模型大鼠左心室内径明显扩大,室壁变薄,收缩运动减弱,心功能降低。第10页/共42页11在体电刺激诱发室颤实验方法参照文献,大鼠麻醉后固定,呼吸机辅助呼吸,开胸暴露心脏,连接刺激电极。采用程控电刺激诱发室颤,记录室颤阈值。柴松波,王硕仁,姚立芳,等.参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的研究.中国中药杂志.2009,34(16):2101-2104第11页/共42页12细胞实验分
5、组与给药方法正常对照组模型组血塞通低剂量组血塞通高剂量组细胞实验以大鼠H9C2心肌细胞系为研究对象,分为两个实验。实验1 1:生脉联合血塞通注射液对H9C2H9C2细胞Cx43Cx43损伤的影响实验2 2:生脉联合血塞通注射液对H9C2H9C2细胞凋亡的影响两个实验均分为以下八组n生脉低剂量组n生脉高剂量组n生脉和血塞通低剂量组n生脉和血塞通高剂量组第12页/共42页13细胞实验1 1:诱导H9C2H9C2细胞Cx43Cx43损伤的方法参照文献,采用TPA造成Cx43的损伤。TPA是一种蛋白激酶C的激活剂,可以增加Cx43的磷酸化,从而降低Cx43通道的通透性,还能显著地降低缝隙连接的组装,并
6、使Cx43失去稳定性。Lampe PD,TenBroek EM,Burt JM,et al.Phosphorylation of connexin43 on serine368 by protein kinase C regulates gap junctional communicationJ.J Cell Biol,2000,149(7):1503-1512.Lampe PD,Lau AF.The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communicationJ.Int J Biochem Cell Biol,2004
7、,36(7):1171-1186.第13页/共42页14细胞实验1 1:H9C2H9C2细胞Cx43Cx43检测方法 采用免疫细胞化学法检测Cx43Cx43的表达主要步骤:用4%4%多聚甲醛固定细胞15min15min,血清封闭,滴加1:1001:100稀释一抗44孵育过夜。次日加二抗,3737孵育30min30min,DABDAB显色,倒置显微镜拍照观察。第14页/共42页15细胞实验2 2:诱导H9C2H9C2细胞凋亡的方法参照文献,使用AngAng诱导心肌细胞凋亡。血管紧张素(AngAng)是一种生物活性物质,可使血管收缩,血压升高,并能够诱导心肌细胞的凋亡。裴兆辉裴兆辉,马虹马虹,朱妙
8、章等朱妙章等.血管紧张素血管紧张素诱导心肌细胞凋亡诱导心肌细胞凋亡机制的研究进展机制的研究进展J.J.心脏杂志心脏杂志,2005,17(5):482-483.,2005,17(5):482-483.第15页/共42页16细胞实验2 2:H9C2H9C2细胞凋亡检测方法 采用HoechstHoechst染色法检测细胞凋亡主要步骤:用4%4%多聚甲醛固定细胞,PBSPBS洗涤1 1次,加入HoechstHoechst染色液,室温孵育10min10min,吸弃染液,PBSPBS洗涤1 1次,倒置荧光显微镜观察拍照,分析凋亡细胞占总细胞数的百分比。第16页/共42页17统计学方法采用SPSS13.0S
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