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1、微生物检测基础微生物检测基础 蒲公英论坛:http:/ 、螺旋体、螺旋体、立克次氏体、衣原体、立克次氏体、衣原体、支原体支原体、放线菌、放线菌、微细藻类微细藻类 、原生动物、原生动物 。12/26/20222病毒病毒没有细胞结构的专性寄生的大分没有细胞结构的专性寄生的大分子生物。子生物。如流感病毒、肝炎病毒(人如流感病毒、肝炎病毒(人体病毒),鸡瘟病毒、口蹄疫病毒体病毒),鸡瘟病毒、口蹄疫病毒(动物病毒),烟草花叶病毒、番茄(动物病毒),烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒(植物病毒),噬菌体(细丛矮病毒(植物病毒),噬菌体(细菌和放线菌病毒)等。菌和放线菌病毒)等。12/26/20223霉菌霉菌 真核
2、生物,单细胞或多细胞丝状真真核生物,单细胞或多细胞丝状真菌菌可用低倍或高倍镜观察其形态。如可用低倍或高倍镜观察其形态。如酿制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛酿制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生产葡萄糖的曲霉菌、生产青霉、生产葡萄糖的曲霉菌、生产青霉素的青霉等。霉素的青霉等。12/26/20224单细胞,介于细菌与病毒之间单细胞,介于细菌与病毒之间的一类原始而小型的原核微生的一类原始而小型的原核微生物。物。支支原体、衣原体、立克次氏体原体、衣原体、立克次氏体12/26/2022512/26/2022612/26/2022712/26/20228四实验室微生物的四实验室微生物的培养培养 12/26/20
3、229 实验室中微生物生长(培养)在液实验室中微生物生长(培养)在液体或固体培养基中。细菌生长的培养基体或固体培养基中。细菌生长的培养基应含所有生长的基本需求:水分、碳源、应含所有生长的基本需求:水分、碳源、氮源、无机盐及生长因子等营养物质。氮源、无机盐及生长因子等营养物质。细菌生长所需的营养物质细菌生长所需的营养物质12/26/202210生长培养基生长培养基 实验室中细菌通常生长(培养,实验室中细菌通常生长(培养,culturedcultured)在摇瓶、瓶子或称作发酵在摇瓶、瓶子或称作发酵罐的大培养容器液体培养基中或在圆罐的大培养容器液体培养基中或在圆的、通常为塑料、灭菌碟子培养皿的的、
4、通常为塑料、灭菌碟子培养皿的固体培养基中。固体培养基中。将微生物引种在这些培养基上称为将微生物引种在这些培养基上称为接种(接种(inoculationinoculation)。)。12/26/202211培养基的性质取决于微生物的天然环境和培养基的性质取决于微生物的天然环境和微生物生长的营养要求。微生物生长的营养要求。分离大量微生物用液体培养基,分离大量微生物用液体培养基,固体培养基用于个别细菌的分离和保存。固体培养基用于个别细菌的分离和保存。12/26/202212 常用血液作培养基的附加成分常用血液作培养基的附加成分分离人类病原菌,由于它提供许分离人类病原菌,由于它提供许多难养的人类病原菌
5、生长的基本多难养的人类病原菌生长的基本营养,如链球菌。特殊的选择培营养,如链球菌。特殊的选择培养基和鉴别培养基经常用于分离养基和鉴别培养基经常用于分离特定的微生物类群,尤其在医院特定的微生物类群,尤其在医院的实验室中。的实验室中。12/26/202213选择培养基与鉴别培养基选择培养基与鉴别培养基设计这些培养基是为设计这些培养基是为选择特定类群选择特定类群的微生物或鉴别两种菌种时用。的微生物或鉴别两种菌种时用。选择培养基含有抑制非目的细菌生选择培养基含有抑制非目的细菌生长的成分,鉴别培养基是添加某种长的成分,鉴别培养基是添加某种营养物或和化学物质,促进所要营养物或和化学物质,促进所要的微生物生
6、长,使在鉴别培养基平的微生物生长,使在鉴别培养基平板上两种不同的微生物的菌落可以板上两种不同的微生物的菌落可以区分开来。区分开来。12/26/202214生长的环境条件生长的环境条件 温度温度 氧浓度氧浓度 PHPH 水活度水活度 12/26/202215温度温度嗜冷微生物适合于嗜冷微生物适合于1010生活的生活的细菌,最适生长温度在细菌,最适生长温度在2020左右。左右。嗜温微生物生长温度在嗜温微生物生长温度在15154545之间,最适生长温度在之间,最适生长温度在3737左右左右的细菌。嗜热微生物生长温度在的细菌。嗜热微生物生长温度在30307575之间,最适生长温度在之间,最适生长温度在
7、5555,在,在100100以上温度生长,称以上温度生长,称为嗜高热微生物为嗜高热微生物。12/26/202216氧浓度氧浓度 根据细菌对氧要求的不同分为好氧根据细菌对氧要求的不同分为好氧菌,厌氧菌,包括专性厌氧菌、兼菌,厌氧菌,包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌、严格厌氧菌和耐氧菌性厌氧菌、严格厌氧菌和耐氧菌微好氧在正常大气氧浓度微好氧在正常大气氧浓度2020情况情况下就受到损伤,只能在更低的氧浓下就受到损伤,只能在更低的氧浓度下才能存活。度下才能存活。12/26/202217pHpH值值 嗜碱菌(嗜碱菌(alkaliphilesalkaliphiles):生长:生长在在高高pHpH(8 8.5 5
8、1111.5 5)的微生物。的微生物。嗜酸菌(嗜酸菌(acidophilesacidophiles):生长在:生长在低低pHpH(0 05.55.5)中的微生物。中的微生物。12/26/202218水活度水活度 像所有生物一样,微生物对周像所有生物一样,微生物对周围环境的渗透压是敏感的。低围环境的渗透压是敏感的。低渗透压时,水将聚集于细胞内,渗透压时,水将聚集于细胞内,高渗透压时水逸出。高渗透压时水逸出。12/26/2022193 3微生物生长的测定方法微生物生长的测定方法 微生物的生长可用原生质的增加、微生物的生长可用原生质的增加、细胞数目的增加或以代谢活动情细胞数目的增加或以代谢活动情况作
9、指标。根据细胞况作指标。根据细胞 的干重或某的干重或某一化学成分如总氮含量数量很少,一化学成分如总氮含量数量很少,以至误差很大。最常采用的微生以至误差很大。最常采用的微生物生长的方法是统计群休数目。物生长的方法是统计群休数目。12/26/202220(1)(1)活菌计数法活菌计数法 有时一个菌落并非绝对地都是由一个单细有时一个菌落并非绝对地都是由一个单细胞所长成的,往往两个或两个以上相连结胞所长成的,往往两个或两个以上相连结的细胞只长成一个单菌落;有些细胞比其的细胞只长成一个单菌落;有些细胞比其它细胞较早地分裂,分裂的速度也快,于它细胞较早地分裂,分裂的速度也快,于是它就首先出现可见的菌落,而
10、其它的细是它就首先出现可见的菌落,而其它的细胞较迟才出现菌落,所以,必须培养足够胞较迟才出现菌落,所以,必须培养足够长的时间,才能使所有的菌落增至足以肉长的时间,才能使所有的菌落增至足以肉眼看见的大小,一般至少需要眼看见的大小,一般至少需要24-4824-48小时,小时,有些生长较缓慢的微生物甚至需要几天至有些生长较缓慢的微生物甚至需要几天至一星期;此外,要控制培养皿内出现的菌一星期;此外,要控制培养皿内出现的菌落数不宜过多。落数不宜过多。12/26/202221(2 2)计算器法)计算器法将待检菌液将待检菌液充分混匀,注入改良纽氏血球计数板,充分混匀,注入改良纽氏血球计数板,计数一定量的菌液
11、中所含菌数,计算出每毫升所计数一定量的菌液中所含菌数,计算出每毫升所含菌数。含菌数。12/26/202222(3 3)比浊法)比浊法据细菌悬浮液的透光量间接测定细据细菌悬浮液的透光量间接测定细菌的数量。菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光的穿透量成反比,与光密度成正光的穿透量成反比,与光密度成正比。对于丝状真菌的生长率,可以比。对于丝状真菌的生长率,可以根据菌丝的生长长度或菌丝增加的根据菌丝的生长长度或菌丝增加的重量。重量。12/26/202223六微生物生长的控制六微生物生长的控制 使工作者免受他们所研究的微生物使工作者免受他们所研究的微生物伤害和所研究的
12、微生物培养物不受伤害和所研究的微生物培养物不受环境中其他微生物污染的方法称作环境中其他微生物污染的方法称作无菌(灭菌)技术。无菌(灭菌)技术。12/26/2022241 1灭菌方法灭菌方法 12/26/202225 方法方法 有效性有效性 应用应用 湿热灭菌法湿热灭菌法 煮沸煮沸/蒸气处理蒸气处理 杀死多数细菌、真杀死多数细菌、真菌的营养细胞和病菌的营养细胞和病毒毒对芽孢无效对芽孢无效 碟子、盆,对热抗碟子、盆,对热抗性的器具性的器具 高压灭菌器高压灭菌器1515磅磅/英寸英寸2 2 121121 杀死所有的营养细杀死所有的营养细菌和芽孢,灭菌时菌和芽孢,灭菌时间长短取决于大存间长短取决于大存
13、在的微生物数量在的微生物数量 培养基、溶液、器培养基、溶液、器具,任何经受热和具,任何经受热和压力的物品压力的物品 巴斯德消毒法巴斯德消毒法71.771.7 15 15秒秒 液体热处理但不能液体热处理但不能杀灭所有细菌。风杀灭所有细菌。风味改变最少味改变最少 牛奶、果汁等牛奶、果汁等 12/26/202226方法方法 有效性有效性 应用应用 间隙灭菌法间隙灭菌法 三次用三次用9090100100煮沸煮沸1010分钟分钟处理,每次处理间处理,每次处理间隔隔2424小时小时 第一天杀死营养细第一天杀死营养细胞,在间隔期间任胞,在间隔期间任何孢芽萌发下一次何孢芽萌发下一次加热处理时再杀死加热处理时再
14、杀死 不能被高压灭菌的不能被高压灭菌的培养基,但对热有培养基,但对热有相对的抗性相对的抗性 干热灭菌法干热灭菌法 灼烧法热空气灭菌灼烧法热空气灭菌法法 炽热直接加热炽热直接加热200200(160160170170译者注)译者注)2 2小时,破坏细胞小时,破坏细胞和芽孢和芽孢 接种环接种环玻璃器具玻璃器具 12/26/202227方法方法 有效性有效性 应用应用 过滤除菌过滤除菌滤滤 器器 孔孔 径径 大大 小小 0.220.220.450.45m m 不能除去病毒不能除去病毒 不能加热处理的液不能加热处理的液体体 辐射辐射 UVUV线线非电离非电离 不能很好穿透材料不能很好穿透材料 物体表面
15、和空气灭物体表面和空气灭菌菌 射线射线电离电离 穿透能力好穿透能力好 药物、塑料制品药物、塑料制品 12/26/202228八微生物的分离八微生物的分离 12/26/202229细菌的纯培养细菌的纯培养 实验室中通常需要细菌的纯培养,即实验室中通常需要细菌的纯培养,即所有的细胞都来自同一个最初的细菌。所有的细胞都来自同一个最初的细菌。采用采用划线平板法和倾注平板法划线平板法和倾注平板法接种细接种细菌到琼脂平板以获得彼此分离的单个菌到琼脂平板以获得彼此分离的单个细菌细胞。经合适温度培养后,每一细菌细胞。经合适温度培养后,每一个细菌形成一个肉眼可见的菌落,含个细菌形成一个肉眼可见的菌落,含有相当于有相当于10109 9个细菌细胞。个细菌细胞。12/26/202230划线划线划线划线烧接种环烧接种环烧接种环烧接种环灭菌通过本生煤气灯灭菌通过本生煤气灯培养后的培养后的单个单个菌落菌落烧接种环烧接种环划线划线划线分离细菌培养物为单菌落的示意图划线分离细菌培养物为单菌落的示意图 12/26/202231转移1ml转移1ml转移1ml加1ml菌液计数10-110-210-310-40.1ml涂布平板计数太多62个菌落计数太少菌落数目稀释倍数细胞数(菌落形成单位,CFU)ml原菌液6210310(吸取0.1ml到平板)6.2105CFU/ml12/26/202232
限制150内