(5.4.1)--4.4暗纹东方鲀线粒体DNA16SrRNA基因克隆、测序与在分子.pdf
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1、暗纹东方鲀线粒体 D N A16Sr R N A 基因克隆、测序与在分子系统发育分析中的应用摘要:以暗纹东方鲀(T a k i f u g uf a s c i a t u s)肝脏线粒体 D N A为模板,按照红鳍东方鲀线粒体 D N A序列设计合成特异引物进行 P C R扩增,获得了暗纹东方鲀线粒体 D N A16Sr R N A基因(1 667 b p)及 3 端上游的 t R N A L e u 基因(73 b p)的全序列。16Sr R N A碱基组成分别为:胸腺嘧啶(T)22.1%,胞嘧啶(C)23.6%,腺嘌呤(A)35.2%,鸟嘌呤(G)19.0%。运用 D N A分析软件对暗
2、纹东方鲀与 G e n B a n k 中鲀形目其他 23种鱼类的 m t D N A16Sr R N A序列进行核苷酸同源性比较分析,分别在鲀形目和东方鲀属水平上利用多种鱼类 D N A16Sr R N A序列构建分子系统树。结果显示,同目不同科间的 16Sr R N A序列核苷酸相似性在 73.6%87.4%之间,同属间的核苷酸相似性高达约 99.0%。在属间、科级、亚目级水平上,利用较长的 16Sr R N A序列构建的 N J 树和 MP树在拓扑图总体趋势相似,各枝的支持率较高。而在东方鲀属内中选取同源性较高的 16Sr R N A部分序列构建分子系统树拓扑结构虽一致,但各枝的支持率不
3、太高。因此认为,16Sr R N A基因较适合于研究鲀形目鱼类中属间、不同种间以及分化较早的种间、科级、亚目级的系统发育分析。本研究结果有助于进一步利用线粒体基因研究分析鲀形目鱼类系统进化关系。关键词:暗纹东方鲀;线粒体 D N A;16Sr R N A基因;克隆;序列测定;系统发育分析中图分类号:Q959.468 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2009)02-0015-05收稿日期:2008-10-08基金项目:农业部行业标准资助项目(编号:2002-04084);苏州科技学院科研基金(编号:2005-Z 862)。作者简介:邵爱华(1968),女,江苏南通人,博士研究生,副
4、教授,研究方向为水生动物分子生物学。T e l:(0512)65880278。通讯作者:朱江。E-m a i l:z j i a n g s u d a.e d u.c o m。自 20世纪 80年代以来,线粒体 D N A(m t D N A)以其较快的进化速度、严格的母系遗传、几乎不发生重组等特征成为群体遗传学和分子系统学研 究的可靠标记 1-3。在线粒体D N A 中,核糖体 R N A 是系统发生研究中的一个非常有用的材料,无论是在建立远缘还是近缘物种之间的进化树,16Sr R N A 均能提供良好的系统发生信息,堪称研究生命体进化的分子钥匙。真核生物的线粒体 12Sr R N A 和
5、 16Sr R N A 被广泛用于分类学上有争议的种属分子进化研究 4-10。鲀形目(T e t r a o d o n t i f o r m e s)鱼类类群较大,约有 350种,形态变化大,广泛分 布于热带和 亚热带海域。东方鲀属(T a k i f u g uA b e)鱼类隶属于鲀形目的一个区域性分布类群,主要分布于日本岛西部到中国沿海,极少数可分布到印度洋。中国东方鲀属已报道 22个种,分布在我国的一些大的河口区域(如珠江、长江等河口)和渤海、黄海、东海及南海等海域 11-13。成庆泰等11依据东方鲀属鱼类头骨的形态特征,结合外部形态和地理分布,深入探讨了其中 15个种的种间关系。
6、在细胞学层面和生化指标上也有诸多研究报道 14-16。自 1997年红鳍东方鲀成为后基因组时代一个研究热点后,鲀形目鱼类对于基因结构和功能的研究逐渐发挥着重要作用 17。近些年来,基于 D N A 序列,特别是线粒体基因序列的分子系统学分析方法开始被较成功地引入到鲀形目鱼类的系统发育研究中。国内外较为重要的研究报道有:S o n g 等 18通过 R A P D 分析认为红鳍东方鲀和假晴东方鲀是同种异名;A k i r a 等19在研究暗纹东方鲀的渗透调节特性时,对东方属 6种鱼进行了系统发生分析,证明东方鲀属内亲缘关系非常近;H o l c r o f t20利用核基因和线粒体基因联合序列对
7、鲀形目分子关系进行了探讨;Y u s u k e 等 21利用线粒体全序列研究鲀形目在硬骨鱼纲中的分类地位;Z h a n g 等22结合 17种东方鲀鱼类的细胞色素 b 和 12S r R N A 基因全序列研究了东方鲀属鱼类系统发育关系。但暗纹东方鲀(T.f a s c i a t u s)线粒体 16Sr R N A 基因全序列未见报道。暗纹东方鲀属鲀科东方鲀属,系北太平洋西部地区性分布的鱼类。暗纹东方鲀肉质鲜美且具有药用价值,是具有极高经济价值的特种水产养殖对象 11,13。本文将首次报道暗纹东方鲀线粒体 16S r R N A 基因全序列的克隆和序列分析结果,与 G e n B a
8、n k 中选取的鲀形目多种鱼类进行核苷酸同源性比较分析,并利用鲀形目不同分类阶元鱼类的 m t D N A16Sr R N A 基因序列构建系统发生树,为进一步探讨鲀形目鱼类系统进化和物种形成方式作尝试,并就线粒体 16Sr R N A 基因在该目鱼类系统进化研究中的应用潜力进行剖析。1 材料与方法1.1 材料与仪器设备供试暗纹东方鲀(养殖体)购自苏州南门水产品市场;限制性内切酶、P r e m i x E x T a q 酶、D N A片段回收试剂盒、p T G 19-T 载体为 T a k a r a 公司产品;D N a s e I、R N a s e、连接酶及其他主要试剂为 S i g
9、 m a 公司产品;大肠杆菌 D H 5 由苏州大学生物化学与分子生物学实验室保存。1.2 暗纹东方鲀线粒体 D N A 的制备活体解剖,取肝脏组织 2 g,m t D N A 的提取参考吴乃虎等 23的方法,对破膜条件及消除核 D N A 污染等进行改进。15江苏农业科学2009年第 2期DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2009.02.1241.3 暗纹东方鲀线粒体 16S r R N A 基因的克隆与筛选1.3.1引物设计 参照红鳍东方鲀线粒体 D N A 序列(G e n-B a n k 登录号 A J 421455),选择位于 16Sr R N A 两侧保守
10、性较高的区域,设计合成暗纹东方鲀 16S r R N A 的 P C R 扩增引物:上游引物 P1:5-G A G G C A A G T C G T A A C A T G G T A A G T-3;下游引物 P2:5-G G T T G G A G G A G T C C G T A A G G T-3。1.3.2P C R 反应体系及条件 P C R 反应体系总体积为 25 l,其中 10 B u f f e r 2.5 l,d N T P2 l,模板 D N A5 l(约 1 g),P11 l,P21 l,加 d d H2O 至 25 l。94 预变性 5 m i n,0 3 m i
11、 n,加 P r e m i x E x T a q 酶 0.2 l,每个循环包括 94 变性 30 s,58.5 退火 30 s,72 延伸 2 m i n,共 35个循环,最后 1次循环结束后,72 延伸 10 m i n,4 保存。1.3.3 扩增产物的回收及阳性克隆的筛选 扩增产物用D N A 片段回收试剂盒纯化回收后,与 p M D18-T 载体进行连接反应,16 过夜。转化大肠杆菌 D H 5 感受态细胞,于含氨苄青霉素的平板上生长过夜,挑选转化子,进行重组子筛选和质粒提取。P C R 扩增法和限制性内切酶酶切法鉴定目的片段的插入。上述操作方法参照 S a m b r o o k
12、等的方法 24。1.4 序列测定和系统发育分析选取 3个经鉴定的重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。根据暗纹东方鲀线粒体 16Sr R N A 的序列,在 G e n-B a n k 数据库中选择 23种同目、同属鱼类的 m t D N A16Sr R N A序列,用 M E G A 3.1 25进行比对,计算不同序列间的核苷酸同源性和碱基组成频率;用 M E G A 软件基于 K i m u r a 2-p a r a m e-t e r 距离采用邻接法(N J)和最大简约法(M P)构建分子系统树。系统树各分支的置信度由 1 000次自举法重复检测。2 结果与分析2.1 暗纹东方鲀线粒
13、体 D N A16S r R N A 及其上游 t R N A 基因的扩增和克隆P C R 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示有 1条清晰明亮的区带,分子量约 1.8 k b。此扩增产物经纯化回收后与 p T G19-T 载体连接转化,筛选重组质粒经 B a m H 和 B l n 双酶切,除去 2.7 k b 的载体外,得到约 1.4 k b 和 0.4 k b 的片段。以重组质粒为模板,P1、P2为引物,扩增得到 1.8 k b 左右的片段。证明所得到的重组质粒有目的片段插入(图 1、图 2)。克隆片段全长为 1 740 b p,其中包括 m t D N A16Sr R N A1 667 b p
14、,以及 3端上游的 t R N A L e u 基因 73 b p。所克隆的序列已在 G e n B a n k 登录(登录号为 E U 346762)。2.2 暗纹东方鲀线粒体 D N A16Sr R N A 的长度及碱基组成暗纹东方鲀 m t D N A16Sr R N A 与其他 17种同目不同总科、科的鱼类以及 8种同属鱼类的比较见表 1。其中同目不同总科、科 的 17 种鱼 包括:三 刺鲀 总科 的双 棘三 刺鲀(A P 009174)、韦氏南 方三刺 鲀(A P 009173)、宽口 管吻鲀(A P 009171)、拟三刺鲀(A P 009172);鳞鲀总科的缰纹多棘鲀(N C 0
15、04416)和丝背细鳞鲀(N C 003177);箱鲀总科的无斑箱鲀(A P 009176)和棘箱鲀(A P 009175);三齿鲀总科的三齿鲀(A P 009170);鲀科的叉鼻鲀属的瓣叉鼻鲀(A P 006742)、扁背鲀属的花冠扁背鲀(A P 006743)和水纹扁背鲀(A P 006744)、东方鲀属的红鳍东方鲀(A J 421455)以及四齿鲀科的青黑斑河鲀(N C 007176);翻车鲀总科的矛尾翻车鲀(N C 005837)、翻车鲀(N C 005836)和斑点长翻车鲀(N C 007887)。同属的除红鳍东方鲀外还有 8种鱼:星点东方鲀(A B 199318)、斑点东方鲀(A
16、B 199319)、豹纹东方鲀(A B 199320)、暗纹东方鲀(A B 199322)、紫色东方鲀(A B 199323)、假晴东方鲀(A F 156975)、黄鳍东方鲀(A F 158556)、中华多纪鲀(A B 437483)。与暗纹东方鲀 16Sr R N A序列的核苷酸同源性和碱基组成进行比较,同属间的核苷酸同源性高达 98.6%99.9%,同目不同科间的核苷酸同源性在 73.6%87.4%之间。同目不同科(6总科 9科)的鲀形目 12种鱼类 16Sr R N A序列一般为 1 672 1 698 b p,与暗纹东方鲀的核苷酸同源性为 73.6%77.6%;同科不同属的 5种鱼类的
17、 16Sr R N A 序列一般为 1 666 1 679 b p,叉鼻鲀属的瓣叉鼻鲀与暗纹东方鲀的核苷酸同源性为 87.4%;扁背鲀属的花冠扁背鲀和水纹扁背鲀与暗纹东方鲀的核苷酸同源性为 86.3%和 86.5%;四齿鲀科的青黑斑河鲀 16S r R N A 序列为 1 677 b p,与暗纹东方鲀的核苷酸同源性为 86.3%。与同属的 6种鱼类 16Sr R N A 部分序列核苷酸同源性比较可知,暗纹东方鲀 m t D N A16Sr R N A 与星点东方鲀的核苷酸同源性为 98.6%;与斑点东方鲀、豹纹东方鲀、紫色东方鲀的核苷酸同源性平均为 99.3%。与 G e n B a n k
18、数据库中学名不同中文名相同的暗纹东方鲀核苷酸同源性高达 99.9%,其16S r R N A 部分序列(1 080 b p)仅存在 1个碱基的差异,即转换 T A。红鳍东方鲀的 16Sr R N A 序列为 1 666 b p,与之相比,暗纹东方鲀 m t D N A16Sr R N A 存在一个碱基位点的插入,没有太多的重复和缺失,两者核苷酸同源性高达 99.4%。16江苏农业科学2009年第 2期表 1暗纹东方鲀与几种同目、同属鱼类的线粒体 D N A16Sr R N A 序列组成比较种类序列总长(b p)核苷酸同源性(%)核苷酸组成(%)TCAG暗纹东方鲀 T.f a s c i a t
19、 u s1 66722.123.635.219.0双棘三刺鲀 T r i a c a n t h u s b i a c u l e a t u s h1 69875.222.223.933.920.0韦氏南方三刺鲀 T r i x i p h i c h t h y s w e b e r i1 67975.222.523.734.019.8宽口管吻鲀 M a c r o r h a m p h o s o d e s u r a d o i1 69178.021.625.532.919.9拟三刺鲀 T r i a c a n t h o d e s a n o m a l u s1 698
20、77.421.525.633.020.0缰纹多棘鲀 S u f f l a m e n f r a e n a t u s1 68075.421.324.034.620.1丝背细鳞鲀 S t e p h a n o l e p i s c i r r h i f e r1 67273.623.423.533.120.0无斑箱鲀 O s t r a c i o ni m m a c u l a t u s1 69277.222.323.635.019.1棘箱鲀 K e n t r o c a p r o s a c u l e a t u s1 69376.922.024.632.820.6三齿
21、鲀 T r i o d o nm a c r o p t e r u s1 69177.021.625.832.420.2瓣叉鼻鲀 A r o t h r o nf i r m a m e n t u m1 67987.420.126.034.719.2花冠扁背鲀 C a n t h i g a s t e r c o r o n a t u s1 67386.320.725.634.719.0水纹扁背鲀 C a n t h i g a s t e r r i v u l a t u s1 67386.521.524.834.419.2青黑斑河鲀 T e t r a o d o n n i g
22、 r o v i r i d i s1 67786.320.425.634.719.3矛尾翻车鲀 M a s t u r us l a n c e o l a t u s1 69075.422.125.631.920.4翻车鲀 M o l aM o l a1 69173.621.626.032.020.4斑点长翻车鲀 R a n z a n i al a e v i s1 68977.622.924.932.220.1红鳍东方鲀 T.r u b r i p e s1 66699.422.123.835.119.0星点东方鲀 T.n i p h o b l e s1 08198.622.224.
23、634.019.2斑点东方鲀 T.p o e c i l o n o t u s1 08099.222.524.333.919.4豹纹东方鲀 T.p a r d a l i s1 08099.322.524.334.119.2暗纹东方鲀 T.o b s c u r u s1 08099.922.523.934.419.3紫色东方鲀 T.p o r p h y r e u s1 08099.422.524.134.219.3假晴东方鲀 T.p s e u d o m m u s56799.224.123.530.421.9黄鳍东方鲀 T.x a n t h o p t e r u s56899.
24、624.323.330.821.7青鳉鱼 O r y z i a s l a t i p e s1 67473.324.320.334.820.5 选取分类地位较为接近的颌针鱼目(B e l o n i f o r m e s)青鳉科(A d r i a n i c h t h y i d a e)的青鳉鱼 O r y z i a s l a t i p e s(N C 004387)作为外群比较:青鳉鱼的 16Sr R N A 序列为 1 674 b p,与暗纹东方鲀的核苷酸同源性为 73.3%。暗纹东方鲀 m t D N A16Sr R N A 的碱基组成分别为:胸腺嘧啶(T)22.1%,
25、胞嘧啶(C)23.6%,腺嘌呤(A)35.2%,鸟嘌呤(G)19.0%,以碱基 A 的含量最高,C 的含量次之,碱基G 的含量最低。与其他 24种鱼类(平均值为:T 21.9%、C24.6%、A 33.8%、G 19.8%)比对,各碱基含量基本相似。几种鱼类线粒体 D N A16Sr R N A 的(A+T)含量均略高于(G+C)含量。从密码子上看,16Sr R N A 全序列中第一、第二、第三位点均未观察出较为明显的碱基偏倚,各位点碱基 G 的含量较为接近,分别为 20.0%、18.2%、18.2%。2.3 以 16Sr R N A 序列为基础构建系统进化树2.3.1 以鲀形目不同科鱼类 1
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