1例中国Gilbert综合征家系UGT1A1基因遗传分析_沈健.pdf
《1例中国Gilbert综合征家系UGT1A1基因遗传分析_沈健.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《1例中国Gilbert综合征家系UGT1A1基因遗传分析_沈健.pdf(5页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、C h i nJ G a s t r o e n t e r o l,2 0 0 7,V o l.1 2,N o.71 例中国 G i l b e r t 综合征家系 U G T 1 A 1 基因遗传分析沈健吴建新*李定国上海交通大学医学院附属新华医院消化内科(2 0 0 0 9 2)背景:国内关于遗传性非结合性高胆红素血症(G i l b e r t综合征)的基因研究极少见。目的:通过分析1例中国G i l b e r t综合征患者及其家系成员的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(U G T)1 A 1基因突变位点,研究其遗传方式。方法:根据肝功能试验和低热量试验结果确诊G i l b e r t综
2、合征患者1例,追踪并抽取该先证者及其5名家系成员的外周静脉血,提取基因组D N A,应用聚合酶链反应(P C R)扩增U G T 1 A 1基因5对外显子以及上游苯巴比妥反应增强元件(P B R E M)和启动子T A T A盒,以直接D N A测序法鉴定U G T 1 A 1基因突变位点。结果:先证者及其4名家系成员P B R E M发生T-3 2 7 9 G突变,T A T A盒发生T A插入突变,形成A(T A)7 T A A,其中先证者及其胞妹之一为突变纯合子。通过血清非结合胆红素水平检测证实了基因型与表现型的关系。结论:T-3 2 7 9 G与A(T A)7 T A A共同作用是导致
3、G i l b e r t综合征家系发病的原因,A(T A)7 T A A对胆红素代谢的影响更为显著,两者高度连锁。G i l b e r t综合征的遗传方式符合常染色体隐性遗传。该家系U G T 1 A 1基因T-3 2 7 9 G和A(T A)7 T A A突变为国内首例报道。关键词吉尔伯特病;尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶;突变;系谱G e n e t i c A n a l y s i s o f U G T 1 A 1 G e n e i na C h i n e s e F a mi l y w i t hG i l b e r t S y n d r o me S H E NJ i
4、a n,WUJ i a n x i n,L I D i n g g u o.D e p a r t m e n t o f G a s t r o e n t e r o l o g y,X i n h u a H o s p i t a l,S h a n g h a i J i a o t o n g U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e,S h a n g h a i(2 0 0 0 9 2)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:WUJ i a n x i n,E m a i l:w
5、j x g p s h 1 6 3.n e tB a c k g r o u n d:T h e r ea r eo n l yf e ws t u d i e so nt h eg e n e t i ca n a l y s i so f i n h e r i t e du n c o n j u g a t e dh y p e r b i l i r u b i n e m i a(G i l b e r t s y n d r o m e)i nC h i n a.A i ms:T oa n a l y z et h em u t a t i o nl o c u so fb i
6、l i r u b i nu r i d i n ed i p h o s p h a t eg l u c u r o n o-s y l t r a n s f e r a s e(U G T)1 A 1g e n e i naC h i n e s ep a t i e n t w i t hG i l b e r t s y n d r o m ea n dh i s f i r s t d e g r e er e l a t i v e s,a n dap e d i g r e ea n a l y s i s o f h e r e d i t yw a s m a d e.M
7、e t h o d s:T h ep a t i e n t(p r o b a n d)w a s d i a g n o s e da s h a v i n gG i l b e r t s y n d r o m eb yl i v e rf u n c t i o nt e s t a n dl o wc a l o r i e t e s t.B l o o ds a m p l e s w e r e c o l l e c t e df r o mt h e p r o b a n da n dh i s f i v e f i r s t d e g r e e r e l
8、a t i v e s,a n dt h eg e n o m i cD N Aw a s e x t r a c t e d.T h ep h e n o b a r b i t a l-r e s p o n s i v ee n h a n c e r m o d u l e(P B R E M),T A T Ab o xa n d5e x o n s o f t h eU G T 1 A 1g e n e w e r e a m p l i f i e db y p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n(P C R)a n dm u t
9、a t i o n s o f t h e U G T 1 A 1g e n e w e r e s c r e e n e db yd i r e c t D N As e q u e n c i n g.R e s u l t s:AT-3 2 7 9 Gm u t a t i o ni nP B R E Ma n da T Ai n s e r t i o ni nT A T Ab o x w e r e o b s e r v e di nt h i sf a m i l y.T h e p r o b a n da n do n e o f h i s s i s t e r s w
10、 e r e h o m o z y g o u s o f t h e s e t w o m u t a t i o n s.T h ec o r r e l a t i o nb e t w e e ng e n o t y p ea n dp h e n o t y p e w i t hh i g hs e r u mu n c o n j u g a t e db i l i r u b i nl e v e l w a s c o n f i r m e d.C o n c l u s i o n s:B o t hT-3 2 7 9 Ga n dA(T A)7 T A Aa r
11、 ee s s e n t i a l f o r t h ep a t h o g e n e s i so f G i l b e r t s y n d r o m ei nt h i sf a m i l y,e s p e c i a l l yA(T A)7 T A A.Ah i g h l ys i g n i f i c a n t l i n k a g ed i s e q u i l i b r i u mi s n o t e db e t w e e nt h e s e t w o m u t a t i o n s.G i l b e r t s y n d r
12、o m e i nt h i s f a m i l y i s i n h e r i t e di na na u t o s o m a l r e c e s s i v em a n n e r.T h i s i s t h e f i r s t r e p o r t o f T-3 2 7 9 Ga n d A(T A)7 T A Am u t a t i o n s i n U G T 1 A 1 g e n e i n C h i n a.K e yw o r d s G i l b e r t D i s e a s e;U r i d i n e D i p h o
13、s p h a t e-G l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e;M u t a t i o n;P e d i g r e eG i l b e r t综合征是临床上最常见的遗传性胆红素代谢障碍性疾病,主要临床表现为肝脏无器质性病变的非溶血性间歇性非结合性高胆红素血症,发病原因为肝脏微粒体的胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(B-U G T)表达下降。近2 0余年,分子生物学技术的发展推进了U G T 1 A 1基因结构异常和功能改变的研究。目前已发现不同人群的G i l b e r t综合征存在遗传背景差异,但这些研究多来自欧美和日本,国内相
14、关报道极少。本研究通过聚合酶链反应(P C R)和直接D N A测序法,对1例中国G i l b e r t综合征家系作详细的U G T 1 A 1基因突变筛查,确定突变位点,并通过检测血清胆红素水平对基因型与表现型的相关性进行验证,旨在明确其遗传规律。对象与方法一、研究对象*本文通讯作者,E m a i l:w j x g p s h 1 6 3.n e t3 9 2胃肠病学2 0 0 7年第1 2卷第7期先证者男,5 7岁,已婚,汉族。自幼即有间歇性黄疸,既往多次实验室检查显示除血清非结合性胆红素增高外,其他肝功能指标均正常。甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒标志物均阴性。网织红细胞计数正常,红
15、细胞形态分析未见异常,红细胞脆性试验正常。肝脏B超检查正常。根据肝功能试验和低热量试验结果诊断为G i l b e r t综合征。同时调查相关家系成员5名,所有受检者均签署知情同意书。采集外周静脉血,行肝功能试验。二、实验试剂与仪器O L Y M P U SA U 6 0 0全自动生化分析仪(日本O l y m p u s公司);基因组D N A提取试剂盒(北京天为时代科技有限公司);U G T 1 A 1基因9对寡核苷酸引物(上海赛百盛基因技术有限公司);E p p e n-d o r f M a s t e r c y c l e r P C R仪(德国E p p e n d o r f公
16、司);F R-9 8 0生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司);A B I 3 7 0 0型D N A测序仪(美国P E公司);三磷酸脱氧核苷(d N T P)和高保真P C R酶(K O D-P l u s-)(日本T o y o b o公司)。三、U G T 1 A 1基因遗传分析1.基因组D N A提取:参照试剂盒说明,抽取先证者及其5名家系成员的外周静脉血,提取全血白细胞基因组D N A,-2 0保存。2.U G T 1 A 1基因引物和扩增反应:根据人类基因文库数据,采用P r i m e r 3.0软件,设计U G T 1 A 1基因上游苯巴比妥反应增强元件(P B R E
17、M)、启动子T A T A盒和5对外显子(其中1号和5号外显子因片段较长,分别设计了2对引物)共9对引物(见表1)。实验引物浓度均为1 0 m o l/L,以基因组D N A为模板行P C R扩增。反应体系中含5 0 2 0 0n g基因组D N A、上下游引物各1 0 m o l/L、0.2m m o l/Ld N T P和K O D-P l u s-1.0 l,P C R缓冲液补充双蒸水至5 0 l。反应条件:9 4预变性2m i n,9 4变性1 5s,退火3 0s(退火温度:P B R E M、启动子T A T A盒、E x 2和E x 4为5 8,E x 1 N 1和E x 5 N
18、1为6 0,E x 1 N 2为6 4,E x 3为5 6,E x 5 N 2为6 2),6 8 延伸3 0s,循环3 0次,6 8终延伸5m i n。3.P C R产物分析:取扩增产物4.0 l行P C R扩增产物分析,1.0 l溴化乙锭染色,1.5%琼脂糖凝胶电泳,生物电泳图像分析系统观察D N A电泳条带并摄影。检测结果采用S m a r t V i e w软件分析。以p B R 3 2 2 D N A/H a e 作为标准分子质量。4.D N A测序与序列分析:取剩余扩增产物,行克隆和D N A测序(上海基康生物技术有限公司)。测序结果与基因文库中的U G T 1 A 1基因序列进行对
19、照,应用S e q u e n c h e r 4.2软件分析测序结果,根据各U G T 1 A 1基因碱基波形判断基因突变位点。四、家系调查和家系遗传图谱分析家系调查问卷内容包括性别、年龄、是否近亲婚配、健康状况、有无慢性肝病、有无遗传疾病史、既往肝功能检查结果、胆红素水平等。获取全部家系成员U G T 1 A 1基因D N A测序分析结果后,根据U G T 1 A 1基因突变并结合胆红素代谢障碍的表现,按遗传作图方法标记出U G T 1 A 1基因突变家系成员的位置,分析突变基因的来源和遗传方式。结果一、血清胆红素水平先证者及其5名家系成员的血清结合胆红素水平均在正常范围内。先证者(-2)
20、和-3血清非结合胆红素水平显著升高,-4和-1轻度升高,-1和-1正常(见表2)。表2 G i l b e r t综合征家系成员血清胆红素水平(mo l/L)例号性别年龄总胆红素结合胆红素非结合胆红素-1女7 91 5.20.31 4.9-1女5 51 7.03.31 3.7-2男5 76 1.43.25 8.2-3女5 63 8.12.93 5.2-4女5 42 1.91.12 0.8-1女2 62 0.81.21 9.6U G T 1 A 1基因片断引物序列产物长度(b p)P B R E MF:5-C A C C T C C T C C T T A T T C T C T T-3 R:5
21、-C T C A T T C C T C C T C T C T A G C C-3 4 0 0启动子T A T A盒F:5-G C C A G T T C A A C T G T T G T T G C C-3 R:5-C C A C T G G G A T C A A C A G T A T C T-3 3 1 5E x 1 N 1F:5-G G T G T A T C G A T T G G T T T T T G C-3 R:5-G G C A G T G C A T G C A A G A A G A-3 6 0 3E x 1 N 2F:5-T T G T C T G G C T G
22、 T T C C C A C T T-3 R:5-T G C C A A A G A C A G A C T C A A A C C-3 6 5 7E x 2F:5-A A C A C G C A T G C C T T T A A T C A T A-3 R:5-T G A C A A C A A C C A C A A C A A C A A A-3 4 1 6E x 3F:5-G A A G T T G C C A G T C C T C A G A A G-3 R:5-T G T T G G C C A T A A T A T T T T C A A G C-3 3 5 6E x 4F
23、:5-A A C A C T G A G T C T T T G G A G T G T T T T C-3 R:5-T A T T T G A A A C A A C G C T A T T A A A T G C T-3 4 2 0E x 5 N 1F:5-C A G G T T T C C T T T C C C A A G T T T-3 R:5-G G G G G C A C G A T A C A T A T T C A-3 6 2 5E x 5 N 2F:5-A A T T A A T C A G C C C C A G A G T G C-3 R:5-G A A G G C G
24、 T G T G T G T G T G A A C-3 7 5 0表1 P C R扩增U G T 1 A 1基因片段、引物序列和产物长度3 9 3C h i nJ G a s t r o e n t e r o l,2 0 0 7,V o l.1 2,N o.7二、外显子测序结果以7对引物扩增5对外显子,得到特异性产物后,再以原引物进行测序。将测序结果与基因文库中的序列进行比对分析,排除了该家系U G T 1 A 1基因5对外显子区域的突变。三、P B R E M测序结果对U G T 1 A 1基因上游P B R E M的测序结果显示先证者及其4名家系成员存在T-3 2 7 9 G突变,其中
25、-2以及-1、-3和-4为突变纯合子,-1为突变杂合子,-1为正常基因型(野生型)(见图1)。四、启动子T A T A盒测序结果对启动子T A T A盒序列的扫描结果显示该家系U G T 1 A 1基因启动子存在T A插入突变,即由正常的A(T A)6 T A A突变为A(T A)7 T A A。其中-2和-3为突变纯合子,-1和-1为突变杂合子,-1和-4为正常基因型(见图2)。五、G i l b e r t综合征家系图谱根 据 测 序 结 果,明 确 了 每 位 家 系 成 员 的U G T 1 A 1基因型,以A(T A)7 T A A等位基因为基础,结合T-3 2 7 9 G和血清非结
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 中国 Gilbert 综合征 家系 UGT1A1 基因 遗传 分析 沈健
限制150内