2 菌种选育.ppt
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1、 第二章 菌种选育v 微生物的特性及工业微生物的要求v 一些工业化产品生产菌种的特点v 菌种的来源v 菌种选育、分子育种生物反应过程原理篇生物反应过程原理篇第一节第一节 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性v 有些微生物能在厌氧的条件下生长;v 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长;v 有些微生物能进行复杂的代谢;v 有些微生物能利用较复杂的化合物;v 有些微生物能在极端的环境下生长。二:工业化菌种的要求二:工业化菌种的要求v 能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物;v 有关合成产物的途径尽可能地简单,或者说菌种改造的可操
2、作性要强;v 遗传性能要相对稳定;v 不易感染它种微生物或噬菌体;v 产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与致病菌无关);v 生产特性要符合工艺要求。放线菌(链霉素、四环素、红霉素等)真菌(青霉素、头孢等)一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物,需要生物体进行复杂的代谢,目前发现的生物来源如下:第二节第二节 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵:用人工诱变的方法,有意识地改变微生物的代谢途径,最大限度地积累产物,这种发酵形象地称为代谢控制发酵,最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50、60年代以氨基酸
3、发酵为代表的代谢控制发酵,是发酵工业发展历史上的一个转折点:HD:HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制 HT:HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求:代谢途径比较清楚,代谢途径比较简单。谷氨酸发酵的菌种:其它氨基酸生产菌:棒杆菌属,短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌。常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成;工程菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌。三、食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶,都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶
4、,美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶:黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌四、常用的基因表达系统(一)原核生物:大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌、沙门氏菌u生长迅速、蛋白产量高;u表达蛋白的纯化、分离及分析快速;u外源基因的导入相对容易;u已建立了整套表达理论及技术.(二)真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)u 生长迅速,营养要求不高,易培养;u安全性好;u比哺乳动物细胞操作简单;u具有一定的修饰蛋白的能力。中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达系统u 具有准确的转录后修饰功能;u 具有产物胞外分越功能,便于
5、下游产物分离纯化;u 具有重组基因的高效扩增和表达能力;u 具有贴壁生长特性,也可进行悬浮生长;u CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物(包括动、植物细胞)几乎可以生产我们所需的一切产品,但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品,只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题:生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸?礼来礼来(Eli lilly),(Eli lilly),花了花了1010年的时间从年的时间从4040万株微万株微生物中,发现了三种有潜力的新抗生素。生物中,发现了三种有潜力的新抗生素。例:u根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏 部门索取或购买;u从大自然中分离筛选新的微生
6、物菌种。第三节 菌种的来源一、菌种的来源2 菌种选育菌种选育uu新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性,采采用用各各种种筛筛选选方方法法,快快速速、准准确确地地把把所所需需要要的的菌种挑选出来。菌种挑选出来。uu实实验验室室或或生生产产用用菌菌种种若若不不慎慎污污染染了了杂杂菌菌,也也必必须须重重新新进进行行分分离纯化。离纯化。uu有了优良的菌种,还要有合适的工艺条件和合理先进的设备有了优良的菌种,还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。与之配合。uu定方案:定方案:定方案:定方案:首先要查阅资料,了解所
7、需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料,了解所需菌种的生长培养特性。uu采样:采样:采样:采样:有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。uu增增增增殖殖殖殖:人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培养养条条件件,使使所所需需菌菌种种增增殖殖培培养后,在数量上占优势。养后,在数量上占优势。uu分离:分离:分离:分离:利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。uu发酵性能测定发酵性能测定发酵性能测定发酵性能测定:进行生产性能测定。进行生产性能测定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐
8、受受最最高高温温度度、生生长长和和发发酵最适温度、最适酵最适温度、最适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤2 菌种选育调查研究及查阅充分的资料调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案设计实验方案 确定采集样品的生态环境确定采集样品的生态环境 采样采样 确定特定的增殖条件确定特定的增殖条件 增殖培养增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法定性或半定量快速检出法 平板平板分离分离分离分离 原种斜面原种斜面 确定发酵培养基础条件确定发酵培养基础条件 筛选筛选 初筛(初筛(1 1株株1 1瓶)瓶)复筛(
9、复筛(1 1株株3 35 5瓶)瓶)结合初步工艺条件摸索结合初步工艺条件摸索 再复筛(再复筛(1 1株株3 35 5瓶)瓶)3 35 5株株 单株纯种单株纯种分离分离分离分离 生产性能试验生产性能试验 毒性试验毒性试验 菌种鉴定菌种鉴定2 菌种选育1 1、采样对象、采样对象 以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。uu一般园田土和耕作过的沼泽土中,以细菌和放线菌为主;一般园田土和耕作过的沼泽土中,以细菌和放线菌为主;富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多,如富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多,如 一些野果生长区和果园内。一些野
10、果生长区和果园内。uu采样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。采样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选 2 2、采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。、采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。3 3、采采土土方方式式:在在选选好好适适当当地地点点后后,用用小小铲铲子子除除去去表表土土,取取离离地地面面5-15cm5-15cm处处的的土土约约10g10g,盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中,扎扎好好,标标记记,记记录录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件件等等,以以备备查查考考。为为了了使使土土样样中中微微生生物物的的数数量量
11、和和类类型型尽尽少少变变化化,宜宜将将样样品品逐逐步步分批寄回,以便及时分离。分批寄回,以便及时分离。2 菌种选育菌种选育 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种,让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加,可可以以通通过过配配制制选选择择性性培培养养基基,选选择择一一定的培养条件来控制定的培养条件来控制富集培养富集培养。例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制,可可选选定定糖糖,淀淀粉粉、纤纤维维素素,或或者者石石油油等等,以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源,那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长
12、,而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。富集的三种方案:u 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件,进行培养。目的微生物富集的一些基本方法目的微生物富集的一些基本方法富集的目的:让目的微生物在种群中占优势,使筛选变得可能。u 当不可能采用定向培养时,则可设计在一个分 类学中考虑,u 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息,这 时只能通过随机分离的办法定向培养的方法定向培养的方法物理方法:加热、膜过滤等.如放线菌材料预处理。但主要是通过培养的方法。定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间
13、4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段,培养(固体、液体;分批连续)后使目的微生物在种群中占优势。实例:碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目)实例:碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目)采样(造纸厂)80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌,嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝1%CMC(羧甲基纤维素),pH10.5培养34天,选择有凹陷圈的菌落。从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型例:醛肟水解酶的筛选例:醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72-Journal of biot
14、echnology 94(2002),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物,补充新鲜培养基不断分析样品,2-3个月后Z-PAOx降低后,稀释分离条菌落目的微生物富集方法的研究进展 分子生物学的实验手段,在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析,基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等。目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。2002,陈文新(科学院院士)2 菌种选育菌种选育 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著,但但还还是是处处于于微微
15、生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离,纯纯化化。在在这这步步,增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用,而而且且控控制制得得细细一一点点,好好一一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法99ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法2.平皿划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法
16、 菌落的选出菌落的选出从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基;利用简单、快速的鉴定方法,如抗生素。从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态,是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长,从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。2 2 菌种选育菌种选育菌种选育菌种选育1.1.菌的营养特征;菌的营养特征;菌的营养特征;菌的营养特征;2.2.菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于4040度的菌种;度的菌种;度的菌种;度的菌种;3.3.菌对所采用的设备和生产过程的适应性;菌对所采用的设备和生产过程
17、的适应性;菌对所采用的设备和生产过程的适应性;菌对所采用的设备和生产过程的适应性;4.4.菌的稳定性;菌的稳定性;菌的稳定性;菌的稳定性;5.5.菌的产物得率和产物在培养液中的浓度;菌的产物得率和产物在培养液中的浓度;菌的产物得率和产物在培养液中的浓度;菌的产物得率和产物在培养液中的浓度;6.6.容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。2 菌种选育菌种选育 这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件,通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验,以以求求得得适适合合于于工工业业生生
18、产产用菌种。用菌种。2 菌种选育菌种选育 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的,将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心,尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种,更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定,微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外,其其他他微微生生物物作作为食用,均需通过两年以上的毒性试验。为食用,均需通过两年以上的毒性试验。2 2 菌种选育菌种选育uu从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的
19、步骤。从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。uu到到目目前前为为止止,还还没没有有一一种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个个试试样样中中所所包包含含的所有微生物总数和种类。的所有微生物总数和种类。uu在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的菌菌株株;在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程程中中,应应及及时时调调整整检检测测方方法法,以以与与各各种种不不同同类类型型的生长和代谢之微生物相适应。的生长和代谢之微生物相适应。uu因此,建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。因此,建立一更为科学的和针对性不强的分离方
20、法是必要的。2 2 菌种选育菌种选育菌种选育菌种选育(1)(1)认真考查所需产品的特征和生产过程;认真考查所需产品的特征和生产过程;(2)(2)制订初步的筛选标准;制订初步的筛选标准;(3)(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。2 2 菌种选育菌种选育菌种选育菌种选育1 1罗列出所要分离的微生物类群;罗列出所要分离的微生物类群;2 2根根据据所所采采集集样样本本的的各各种种生生态态参参数数,描描述述所所要要分分离离的的微微生生物物之生态系统或栖息地:之生态系统或栖息地:3 3将将若若干干样样本本分分成成若若干干类类型型,如如植植物物和和植植物物各各部部,土土
21、壤壤(类类型型和土层和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等;、岩石、水、昆虫和发酵食品等;4 4罗罗列列出出所所要要考考察察和和测测量量的的环环境境参参数数,如如pHpH、盐盐分分、水水分分、氧化还原电势及温度等;氧化还原电势及温度等;5 5列出生物系统中有用的自然底物,如森林土壤中的几丁质、列出生物系统中有用的自然底物,如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶;葡萄表皮的果胶;6 6根据上述根据上述1-51-5项中所获得的数据,设计分离方法,即选择适项中所获得的数据,设计分离方法,即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件;宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件;7 7用标准方法作
22、对照来评价生态学分离方法;用标准方法作对照来评价生态学分离方法;8 8根据待检材料的生态参数需要,修改已知的方法;根据待检材料的生态参数需要,修改已知的方法;9 9运用特定的富集方法,富集那些可能具有筛选意义的微生物运用特定的富集方法,富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。类群。2 2 菌种选育菌种选育 为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群,特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中中出出现现的的菌菌群群时时,必必须须十十分分重视样本的采集。重视样本的采集。样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌
23、菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。细菌的分离细菌的分离2 2 菌种选育菌种选育菌种选育菌种选育1 1、采样时应尽可能保持相对无菌;、采样时应尽可能保持相对无菌;2 2、所采集的样本必须具有某种代表性;、所采集的样本必须具有某种代表性;3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及 采集地点的地理、生态参数等;采集地点的地理、生态参数等;4 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素,因为真正的原地菌群、应充分考虑采样的季节性和时间因素,因为真正的
24、原地菌群 的出现可能是短暂的;的出现可能是短暂的;5 5、采好的样应及时处理,暂不能处理的也应贮存于、采好的样应及时处理,暂不能处理的也应贮存于44下,但下,但 贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束,试样中的微生贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束,试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境,其内部生态环境就会发生物群体就脱离了原来的生态环境,其内部生态环境就会发生 变化,微生物群体之间就会出现消长。变化,微生物群体之间就会出现消长。2 2 菌种选育菌种选育1 1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用于于平平
25、板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都都会会影影响响实实验验中中所所要要分分离离的的细菌的数量和种类。细菌的数量和种类。2 2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成而而言言,部部分分培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物,部部分分培培养养基基中中则则应应含含有多种碳、氮源,如几丁质、纤维素或果胶。有多种碳、氮源,如几丁质、纤维素或果胶。3 3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素如放线菌酮和制霉素),掺加浓度一般为掺加浓度一般为50g50gm1m1,
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