2. 菌种选育.ppt
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1、 第二章 菌种选育v 微生物的特性及工业微生物的要求v 一些工业化产品生产菌种的特点v 菌种的来源v 菌种选育、分子育种生物反应过程原理篇生物反应过程原理篇第一节第一节 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性v 有些微生物能在厌氧的条件下生长;v 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长;v 有些微生物能进行复杂的代谢;v 有些微生物能利用较复杂的化合物;v 有些微生物能在极端的环境下生长。二:工业化菌种的要求二:工业化菌种的要求v 能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物;v 有关合成产物的途径尽可能地简单,或者说菌种改造的可操
2、作性要强;v 遗传性能要相对稳定;v 不易感染它种微生物或噬菌体;v 产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与致病菌无关);v 生产特性要符合工艺要求。放线菌(链霉素、四环素、红霉素等)真菌(青霉素、头孢等)一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物,需要生物体进行复杂的代谢,目前发现的生物来源如下:第二节第二节 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵:用人工诱变的方法,有意识地改变微生物的代谢途径,最大限度地积累产物,这种发酵形象地称为代谢控制发酵,最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50、60年代以氨基酸
3、发酵为代表的代谢控制发酵,是发酵工业发展历史上的一个转折点:HD:HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制 HT:HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求:代谢途径比较清楚,代谢途径比较简单。谷氨酸发酵的菌种:其它氨基酸生产菌:棒杆菌属,短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌。常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成;工程菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌。三、食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶,都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶
4、,美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶:黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌四、常用的基因表达系统(一)原核生物:大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌、沙门氏菌u生长迅速、蛋白产量高;u表达蛋白的纯化、分离及分析快速;u外源基因的导入相对容易;u已建立了整套表达理论及技术.(二)真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)u 生长迅速,营养要求不高,易培养;u安全性好;u比哺乳动物细胞操作简单;u具有一定的修饰蛋白的能力。中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达系统u 具有准确的转录后修饰功能;u 具有产物胞外分越功能,便于
5、下游产物分离纯化;u 具有重组基因的高效扩增和表达能力;u 具有贴壁生长特性,也可进行悬浮生长;u CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物(包括动、植物细胞)几乎可以生产我们所需的一切产品,但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品,只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题:生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸?礼来礼来(Eli lilly),(Eli lilly),花了花了1010年的时间从年的时间从4040万株微万株微生物中,发现了三种有潜力的新抗生素。生物中,发现了三种有潜力的新抗生素。例:u根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏 部门索取或购买;u从大自然中分离筛选新的微生
6、物菌种。第三节 菌种的来源一、菌种的来源二、分离思路二、分离思路 u新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性,采用各种筛选方法,快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。u实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌,也必须重新进行分离纯化。u有了优良的菌种,还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。u定方案:定方案:首先要查阅资料,了解所需菌种的生长培养特性。u采样:采样:有针对性地采集样品。u增增殖殖:人为地通过控制养分或培养条件,使所需菌种增殖培养后,在数量上占优势。u分离:分离:利用分离技术得到纯种。u发酵性能测定发酵性能测定:进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营
7、养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤菌种筛选主要步骤:调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案 确定采集样品的生态环境 采样 确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离分离 原种斜面 确定发酵培养基础条件 筛选 初筛(1株1瓶)复筛(1株35瓶)结合初步工艺条件摸索 再复筛(1株35瓶)35株 单株纯种分离分离 生产性能试验 毒性试验 菌种鉴定(一)采样一)采样1、采样对象 以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。u一般园田土
8、和耕作过的沼泽土中,以细菌和放线菌为主;富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多,如 一些野果生长区和果园内。u采样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选 2、采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。3、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。(二)增殖(富集)培养(二)增殖(富集)培养 为了容易分离到所需的菌种,让无关的微生物至少是在数量上不要增加,可以通过
9、配制选择性培养基,选择一定的培养条件来控制富集培养。例如碳源利用的控制,可选定糖,淀粉、纤维素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源,那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。富集的三种方案:u 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件,进行培养。目的微生物富集的一些基本方法目的微生物富集的一些基本方法富集的目的:让目的微生物在种群中占优势,使筛选变得可能。u 当不可能采用定向培养时,则可设计在一个分 类学中考虑,u 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息,这 时只能通过随机分离的办法定向培养的方法定向培养的方法物理方法:
10、加热、膜过滤等.如放线菌材料预处理。但主要是通过培养的方法。定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段,培养(固体、液体;分批连续)后使目的微生物在种群中占优势。实例:碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目)实例:碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目)采样(造纸厂)80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌,嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝1%CMC(羧甲基纤维素),pH10.5培养34天,选择有凹陷圈的菌落。从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型例:醛肟水解酶的筛选例:醛肟水解酶的筛选 -
11、Journal of biotechnology 94(2002),65-72-Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物,补充新鲜培养基不断分析样品,2-3个月后Z-PAOx降低后,稀释分离条菌落目的微生物富集方法的研究进展 分子生物学的实验手段,在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析,基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等。目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。2002,陈文新
12、(科学院院士)(三)培养分离(三)培养分离 尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离,纯化。在这步,增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用,而且控制得细一点,好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法99ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法2.平皿划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法 菌落的选出菌落的选出从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产
13、物的形成有目的的设计培养基;利用简单、快速的鉴定方法,如抗生素。从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态,是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长,从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。在要求获得高产菌株的同时,还应考虑推广到生产过程在要求获得高产菌株的同时,还应考虑推广到生产过程时的经济问题,在筛选所需菌株时宜考虑的一些重要指标:时的经济问题,在筛选所需菌株时宜考虑的一些重要指标:1.菌的营养特征;菌的营养特征;2.菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于40度的菌种;度的菌种;3.菌对所采用的设备和生产过程的适应性;菌对所采用的设备和生产过程的适应性;4.菌的
14、稳定性;菌的稳定性;5.菌的产物得率和产物在培养液中的浓度;菌的产物得率和产物在培养液中的浓度;6.容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。(四)筛(四)筛 选选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,以求得适合于工业生产用菌种。(五)毒性试验(五)毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的,将其作为生产菌种应当十分当心,尤其与食品工业有关的菌种,更应慎重。据有的国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,其他微生物作为食用,均需通过两年以上的毒性试验。目的微生物培养分离目的微生物培养分离u从自然
15、界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。u到目前为止,还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。u在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株;在工业微生物筛选过程中,应及时调整检测方法,以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。u因此,建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。1、成功的分离培养方法、成功的分离培养方法(1)认真考查所需产品的特征和生产过程;(2)制订初步的筛选标准;(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。2、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点1罗列出所要分离的微生物类群;2根据所采集
16、样本的各种生态参数,描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地:3将若干样本分成若干类型,如植物和植物各部,土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等;4罗列出所要考察和测量的环境参数,如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等;5列出生物系统中有用的自然底物,如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶;6根据上述1-5项中所获得的数据,设计分离方法,即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件;7用标准方法作对照来评价生态学分离方法;8根据待检材料的生态参数需要,修改已知的方法;9运用特定的富集方法,富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。(一一)采样和采集方法采样和采集方法 为了从一特定生态
17、系统中分离出具有代表性的细菌菌群,特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时,必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。细菌的分离细菌的分离采样的注意事项采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌;2、所采集的样本必须具有某种代表性;3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及 采集地点的地理、生态参数等;4、应充分考虑采样的季节性和时间因素,因为真正的原地菌群 的出现可能是短暂的;5、采好的样应及时处理,暂不能处理的也应贮存于4下,但 贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束,试样中的微生 物群体就脱离了
18、原来的生态环境,其内部生态环境就会发生 变化,微生物群体之间就会出现消长。(二二)生态学参数及培养基的组成原则生态学参数及培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言,部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物,部分培养基中则应含有多种碳、氮源,如几丁质、纤维素或果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素),掺加浓度一般为50gm1,以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物
19、理学参数,如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。二、分离分离 目的微生物不纯,需分离分离纯化。采用简便迅速,有一定准确性的检出方法,提高筛选效率。常用平皿反应法:u纸片培养显色法纸片培养显色法:浸有指示剂滤纸。u透明圈法透明圈法:混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。u变色圈法变色圈法:直接用显色剂或指示剂。u生长圈法生长圈法:利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌,要分离分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长,形成生长圈。u抑制圈法抑制圈法:琼脂块培养法。用刚果红染色法鉴定筛选降用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株解纤维素的菌株 羧甲
20、基纤维素钠作培养物羧甲基纤维素钠作培养物抗生素筛选抗生素筛选检定菌培养,加上发酵液检定菌培养,加上发酵液放线菌的分离培养基的组成原则放线菌的分离培养基的组成原则u大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外,其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。u在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮,以抑制真菌的繁殖。u选择性地添加抗生素。u分离琼脂平板制备好后,一般皆应在37培养箱中存放3天。放线菌的分离放线菌的分离u土样中放线菌的非选择性分离:土样风干,磨碎,无菌海绵压印土样后压印平板后培养。u植物体上放线菌的分离:无菌取植物组织,干燥
21、以减少细菌数量,剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。u水中放线菌的分离:为使所要分离的放线菌的数量种类增多,一般将水样离心或滤纸过滤,取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。放线菌的分离放线菌的分离次代培养及纯化次代培养及纯化u菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异,作初步的鉴定和区分。u通过高倍放大进行镜检,可了解气生和营养孢子形成情况。u成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基;而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定,在分离放线菌时显得尤为重要。u将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取,点
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