综合性设计性实验.ppt
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1、综合性设计性实验综合性设计性实验-3-3A蛋白质翻译后修饰位点预测蛋白质翻译后修饰位点预测A醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素血红蛋白和细胞色素CA目标蛋白的目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定电泳分离分析及其生物质谱鉴定此实验共包括如下三个部分此实验共包括如下三个部分1.1.第一部分,蛋白质翻译后修饰位点预测第一部分,蛋白质翻译后修饰位点预测2.2.第二部分,醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳第二部分,醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳3.3.第三部分,目标蛋白的第三部分,目标蛋白的2D2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定电泳分
2、离分析及其生物质谱鉴定第一部分,蛋白质翻译后修饰位点预测第一部分,蛋白质翻译后修饰位点预测泛泛素素化化对对于于细细胞胞分分化化与与凋凋亡亡、DNA修修复复、免免疫疫应应答答和和应应激激反反应应等等生生理理过过程程起起着重要作用;着重要作用;磷磷酸酸化化涉涉及及细细胞胞信信号号转转导导、神神经经活活动动、肌肌肉肉收收缩缩以以及及细细胞胞的的增增殖殖、发发育育和和分分化等生理病理过程;化等生理病理过程;糖糖基基化化在在许许多多生生物物过过程程中中如如免免疫疫保保护护、病病毒毒的的复复制制、细细胞胞生生长长、炎炎症症的的产产生生等起着重要的作用;等起着重要的作用;脂基化对于生物体内的信号转导过程起着
3、非常关键的作用;脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用;组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂,蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完善,调节更为精细,作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛功能更为完善,调节更为精细,作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。甘露糖化修饰预测甘露糖化修饰预测:N位糖基化修饰预测:位糖基化修饰预
4、测:http:/O位糖基化修饰预测:位糖基化修饰预测:豆蔻酰化位点预测:豆蔻酰化位点预测:乙酰化位点预测:乙酰化位点预测:http:/磷酸化位点预测:磷酸化位点预测:http:/以以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果电泳的含义电泳的含义带电的胶粒或大分子在外加电场中,向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。带电的胶粒或大分子在外加电场中,向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用电泳的应用1.1.分离各种有机物:如蛋白质、酶、核酸等分离各种有机物:如蛋白质、酶、核酸等2.2.分析某种物质的纯度及分子量分析某种物质的纯度及分子量第二部分,醋酸
5、纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳第二部分,醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳电泳的基本原理电泳的基本原理在电场中,推动带电质点运动的力(在电场中,推动带电质点运动的力(F)等于质点所带净电荷量(等于质点所带净电荷量(Q)与电场强度(与电场强度(E)的乘积。的乘积。FQE 质点的前移同样要受到阻力(质点的前移同样要受到阻力(F)的影响,对于一个球形质点,服从的影响,对于一个球形质点,服从Stoke定律,即:定律,即:F6r(r为质点半径,为质点半径,为介质粘度,为介质粘度,为质点移动速度)为质点移动速度)当质点在电场中作稳定运动时:当质点在电场中作稳定运动时:FF即:即:QE6r在同一电泳条件下,不同的物
6、质因其分子大小(在同一电泳条件下,不同的物质因其分子大小(r)和带电量()和带电量(Q)的差异而具有不同)的差异而具有不同的泳动速度,因此,电泳一定的时间(的泳动速度,因此,电泳一定的时间(t)就可互相分离。)就可互相分离。EqfqEghghn n6=待分离大分子的性质待分离大分子的性质 :所带的电荷、分子大小和形状。:所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。电场强度:过高,产热,蛋白变性导致不能分离;电场强度:过高,产热,蛋白变性导致不能分离;缓冲液水分蒸发过多,离子强
7、度增缓冲液水分蒸发过多,离子强度增加;虹吸现象等。过低,电泳时间增加,扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间加;虹吸现象等。过低,电泳时间增加,扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时,需附有冷却装置。时,需附有冷却装置。电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动;当电渗方向与电泳方向一致时,会加电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动;当电渗方向与电泳方向一致时,会加快颗粒泳动速度,反之,当两者方向相反时,会减慢颗粒泳动速度。快颗粒泳动速度,反之,当两者方向相反时,会减慢颗粒泳动速度。支持介质的筛孔支持介质的筛孔 :筛孔越小,则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。:筛孔越小,则颗粒在移动的
8、过程中所受到的阻力也就越大。缓冲液缓冲液pHpH和离子强度:和离子强度:pHpH值距离其等电点愈远,其所带净电荷量就越大,电泳的速度值距离其等电点愈远,其所带净电荷量就越大,电泳的速度也就越大也就越大 ;但是;但是pHpH过高或过低引起蛋白变性,缓冲液通常要保持一定的离子强度;过高或过低引起蛋白变性,缓冲液通常要保持一定的离子强度;强度过低,则缓冲能力差,不易维持强度过低,则缓冲能力差,不易维持PHPH恒定,离子强度过高,在待分离分子周围形成恒定,离子强度过高,在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛),降低了蛋白质的带电量,使电泳速度较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛)
9、,降低了蛋白质的带电量,使电泳速度减慢。一般所用离子强度为减慢。一般所用离子强度为0.020.020.20.2之间。之间。电泳的影响因素电泳的影响因素血清蛋白醋酸纤维膜电泳血清蛋白醋酸纤维膜电泳实验目的实验目的 掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义熟悉电泳仪器的使用和操作熟悉电泳仪器的使用和操作 +白蛋白白蛋白(A)12血清蛋白的血清蛋白的pI大多在大多在7.5以下,在以下,在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在,并且蛋白质的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在,并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异,在电场中迁移速度不同,可以在醋酸纤
10、的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异,在电场中迁移速度不同,可以在醋酸纤维薄膜上分离成维薄膜上分离成A、1、2、和和五条区带。五条区带。蛋白名称蛋白名称等电点等电点分子量分子量白蛋白白蛋白4.88690005.061:200002:300005.1290000-1500006.85-7.50156000-300000醋酸纤维素(二乙酸纤维素)薄膜具有匀一的泡沫状结构,渗透性强,对分子醋酸纤维素(二乙酸纤维素)薄膜具有匀一的泡沫状结构,渗透性强,对分子移动无阻力,用它作区带电泳的支持物,具有用样量少,分离清晰,无吸附作移动无阻力,用它作区带电泳的支持物,具有用样量少,分离清晰,无吸附作用。
11、目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜经醋酸纤维素薄膜经1,41,4二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明,因而可得背二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明,因而可得背景为无色的电泳图谱。景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性醋酸纤维素薄膜的特性实验操作及注意事项实验操作及注意事项1.膜的预处理:将薄膜切成膜的预处理:将薄膜切成2.58cm,无光泽面向下,漂浮于巴比妥缓冲液面上,膜条无光泽面向下,漂浮于巴比妥缓冲液面上,膜条自然浸湿下沉。取充分浸透的膜条,滤纸吸取多余的缓冲液,不要弄太干。自然
12、浸湿下沉。取充分浸透的膜条,滤纸吸取多余的缓冲液,不要弄太干。2.加样:光面用铅笔标注,无光泽面距一端加样:光面用铅笔标注,无光泽面距一端1.5cm处用点样器蘸取新鲜血清点样(不能处用点样器蘸取新鲜血清点样(不能看见有液滴形成),待血清进入膜内,移开点样器。看见有液滴形成),待血清进入膜内,移开点样器。3.电泳:放置于电泳槽架时,无光泽面向下,点样端置于负极,膜与电极紧密接触,电泳:放置于电泳槽架时,无光泽面向下,点样端置于负极,膜与电极紧密接触,不能留有气泡,平衡不能留有气泡,平衡5分钟,通电分钟,通电1h。4.染色:通电完毕,镊子取出,浸于氨基黑的染色液中染色:通电完毕,镊子取出,浸于氨基
13、黑的染色液中5分钟,立即放入盛有漂洗液的培养分钟,立即放入盛有漂洗液的培养皿中,反复漂洗数次,直至背景漂净,滤纸吸干,不要太干。皿中,反复漂洗数次,直至背景漂净,滤纸吸干,不要太干。5.定量:定量:取取6支试管,编号,分别用吸管吸取支试管,编号,分别用吸管吸取0.4N NaOH 4ml;剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条(空白带的宽度以最窄的条剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条(空白带的宽度以最窄的条带为准)。将各条分别浸于上述试管内(注意管与蛋白带的顺序),用力摇动,使蓝色带为准)。将各条分别浸于上述试管内(注意管与蛋白带的顺序),用力摇动,使蓝色洗出,约
14、半小时;洗出,约半小时;用分光光度计进行比色,波长用分光光度计进行比色,波长650nm,以空白薄膜条洗出液为空白对照,读取以空白薄膜条洗出液为空白对照,读取A、1、2、球蛋白各管的光密度。球蛋白各管的光密度。6.计算:计算:光密度总和光密度总和 T A+1+2+白蛋白白蛋白A/T100%1球蛋白球蛋白 1/T 100%2球蛋白球蛋白 2/T 100%球蛋白球蛋白/T 100%球蛋白球蛋白/T 100%临床意义临床意义正常值:正常值:白蛋白:白蛋白:5772%1球蛋白:球蛋白:25%2球蛋白:球蛋白:49%球蛋白:球蛋白:6.512%球蛋白:球蛋白:1220%急性肝炎:发病早期蛋白质电泳无变化,
15、发病两周后白蛋白、急性肝炎:发病早期蛋白质电泳无变化,发病两周后白蛋白、2及及球蛋白减少,球蛋白减少,球蛋球蛋白增高。白增高。慢性肝炎:慢性肝炎:球蛋白升高,白蛋白下降较急性肝炎显著。球蛋白升高,白蛋白下降较急性肝炎显著。肝硬化:白蛋白、肝硬化:白蛋白、1、2球蛋白均明显下降,球蛋白均明显下降,球蛋白极度升高,甚至球蛋白极度升高,甚至A/G比值倒置。比值倒置。肾病综合征时,白蛋白降低,肾病综合征时,白蛋白降低,2、球蛋白升高。球蛋白升高。聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验目的实验目的学习等电聚焦电泳分离血清蛋白的原理学习等电聚焦电泳分离血清蛋白的原理学习聚丙烯酰胺作为电泳
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- 关 键 词:
- 综合性 设计 实验
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