模板制备学习.pptx
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1、PCRPCR模板制备模板制备1PCR1PCR的模板与制备的模板与制备PCRPCR模板的使用模板的使用粗样品中的粗样品中的PCRPCR抑制剂抑制剂中山大学药学院第1页/共46页PCRPCR模板制备与纯化模板制备与纯化DNADNA和和RNARNA均可作为均可作为PCRPCR扩增反应的模板,但一般情况下,扩增反应的模板,但一般情况下,mRNAmRNA先逆转录成先逆转录成cDNAcDNA再进行再进行扩增。扩增。PCRPCR模板的来源主要有两大类:模板的来源主要有两大类:纯净物纯净物如重组质粒、制备的染色体如重组质粒、制备的染色体DNADNA、回收的回收的DNADNA片段片段粗样品粗样品如粪便、脑脊髓液
2、、血液、食物、动物贝壳、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷嚏液、痰液等组织切片、脓汁、喷嚏液、痰液等 第2页/共46页PCRPCR模板的使用模板的使用PCRPCR模板模板的标准使用范围:的标准使用范围:101022-10-1055拷贝拷贝特异性的改进:特异性的改进:增加模板增加模板DNADNA的量、降低引物与模板的分子比的量、降低引物与模板的分子比 有效性的改进:有效性的改进:增加引物与模板的分子比增加引物与模板的分子比 模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列,但一般模板浓度的变化很大程度上取决
3、于待扩增的碱基序列,但一般而言,模板而言,模板DNADNA长度小,长度小,PCRPCR扩增产物的量就大,因此对于大分子扩增产物的量就大,因此对于大分子量的模板量的模板DNADNA(尤其是真核生物基因组尤其是真核生物基因组DNADNA),),在扩增之前最好先在扩增之前最好先用超声波处理或限制性酶消化用超声波处理或限制性酶消化。第3页/共46页2PCR2PCR的模板纯化核酸提取的模板纯化核酸提取第一部分:DNA提取方法简介第二部分:DNA提取常见问题及其对策第三部分:RNA提取方法简介第四部分:RNA提取常见问题及对策中山大学药学院第4页/共46页基因组DNA的提取第一部分:DNA提取方法简介 植
4、物基因组植物基因组DNADNADNADNACTABCTABCTABCTAB法法动物基因组动物基因组DNADNASDSSDS法法中山大学药学院第5页/共46页植物基因组植物基因组DNADNACTABCTAB法法CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。中山大学药学院第6页/共46页qCTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)NaClCT
5、AB-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%(V/V)使用前加入Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除第7页/共46页qCTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)NaClCTABPVP40-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%(V/V)使用前加
6、入vPVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。中山大学药学院第8页/共46页qCTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液第9页/共46页第10页/共46页q SDS法原理动物基因组动物基因组DNADNASDSSDS法法SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(5565)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后
7、用乙醇沉淀水相中的DNA。中山大学药学院第11页/共46页q SDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%中山大学药学院第12页/共46页q SDS法流程图(以动物组织为例)动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液第13页/共46页基因组基因组DNADNA其它方法其它方法吸附材料结合法:q根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低pH值结合核酸,低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸,高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附
8、不同的目的物,从而达到分离目的。中山大学药学院第14页/共46页浓盐法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物中山大学药学院第15页/共46页q非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法中山大学药学院第16页/共46页质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子;当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发
9、生变性,共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象;变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中山大学药学院第17页/共46页q碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液第18页/共46页质粒质粒DNADNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子;当加热处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象
10、;变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中山大学药学院第19页/共46页第20页/共46页细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋白,它们的比重和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度也一定,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来中山大学药学院第21页/共
11、46页DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中中山大学药学院第22页/共46页材料准备材料准备最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时,要选择有核细胞(白细胞)组培细胞培养时间不能过长,否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少,提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌体导致开环质粒增加)培养时应加入筛选压力,否则菌体易污染,质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝或大质粒,则应加大菌体用量菌株不要
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