流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化 (1).pdf
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1、作者单位:1 云 南沃森生物 技术有限公 司研发中 心(昆明650118);2 华中师范大学生命科学学院 昆虫学研究所(武汉 430074).通讯作者:代云波,E-mail:中国图书分类号 R37311+3 文献标识码 A 文章编号 1004-5503(2008)01-036-04=预防制品流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化杨1 刘红岩1 马波1 郭仁1 彭建新2 谢飞1 侯峰1 代云波1=摘要 目的 优化大规模生产的流感病毒裂解疫苗的纯化及裂解工艺。方法 比较凝胶层析和蔗糖密度梯度超速离心的纯化效果,以及 Triton X-100和去氧胆酸钠两种裂解剂在不同条件下的裂解效果。结果 层析法纯度稍
2、高于蔗糖密度梯度超速离心法,而蔗糖密度区带超速离心法的收率优于层析法。Triton X-100 的裂解效果优于去氧胆酸钠,裂解剂浓度为0.5%或0.8%,裂解 3 或 4 h,裂解率达 90%以上。疫苗在 4e 保存 1年后,所有检测项目均合格,4e 保存 18 个月和 37e 保存28 d后,HA 含量仍保持在 30Lg/ml以上。结论 已建立了切实可行的流感病毒裂解疫苗规模生产的纯化及裂解工艺。=关键词 流感裂解疫苗;纯化;裂解Optimization of Procedure for Purification and Lysis of Influenza Virus VaccineYAN
3、G Zhev,LIU Hong-yan,MA Bo,et al(vWalvax BioTech Co.Ltd,Kunming 650018,China)=Abstract Objective To optimize the procedure for purification and lysis of influenza virus vaccine.Methods Compare the purificationefficacies by gel filtration chromatography and by sucrose density gradient centrifutgation,
4、as well as the lysis efficacies withTriton X-100 andwithsodium deoxycholate under various conditions.Results The purity of split influenza vaccine after purification by gel filtration chromatography wasslightly higher than that by sucrose density gradient ultracentrifugation,while the recovery of va
5、ccine by the latter was higher than that by the for-mer.Triton X-100 showed good lysis efficacy as compared with sodium deoxycholate.After lysis with Triton X-100 at a final concentration of0.5%or 0.8%for 3 or 4 h,more than 90%of influenza vaccine was lyzed.After storage at 4efor 12months,allthe qua
6、lity indexes of thepurified vaccine met the relevant requirements.However,after storage at 4e for 18 months or at 37e for 28 d,the HA content of vaccine wasstill more than 30 Lg/ml.Conclusion A practical and feasible procedure for purification and lysis of influenza vaccine was developed.=Key words
7、Split influenza virus vaccine;Purification;Lysis 本文根据WHO 规程有关规定和5中国药典6三部(2005 版)相关规定,并参阅文献,对流感疫苗裂解病毒抗原超速密度区带离心及凝胶层析纯化病毒的具体方法进行了优化,建立了有效的规模化生产疫苗的裂解和纯化工艺。11 材料与方法111 鸡胚种子批制备使用 9 11 日龄 SPF 鸡胚,来自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;疫苗制备使用封闭饲养健康鸡群的 9 11 日龄鸡胚,来自昆明实验养鸡场。112 病毒3 个流行性感冒病毒毒种来自 NIBSC,具有完整的历史和质量背景资料。即H1N1 A/New C
8、aledonia/20/99(简称 A1)、H3N2 A/New York/55/2004(简称A3)和 B/JiangSu/10/2003株(简称 B)。113 试剂及仪器Serazym Ovalbumin ELISA 试剂盒购自Seramun D-iagnostica GmbH;牛血清白蛋白标准品购自中国药品生物制品检定所;蛋白纯化仪AKTA explorer100 为 Phar-macia 产品;介质Sepharose 4 FF 为Pharmacia 产品。114 病毒培养及纯化取工作种子,以稀释度 10-3接种于11 日龄的普通鸡胚,经 35e 培养 72 h 后,置 4e 冷胚过夜,
9、收获尿囊液。分别对不同批次的尿囊液进行检测,将无菌试验、灭活试验合格且血凝滴度大于 1B240 的尿囊液合并;将单型病毒原液经10 L m 粗滤后,再经3、0.45 和 0.22 L m 膜过滤,最后用相对分子质量为300 000的 膜 包 进 行 约 50 倍 超 滤 浓 缩,再 经Sepharose 4FF 凝胶层析纯化或蔗糖密度区带超速离心纯化。114.1 Sepharose 4FF 凝胶层析:以 0101 mol/L PBS(pH7.4)为平衡缓冲液;0101 mol/L PBS(pH7.4)为洗脱缓冲液;流速 1.0 ml/min;病毒液经层析纯化后,收集洗脱峰,用直接血凝法检测效价
10、。#36#中国生物制品学杂志 2008 年1 月第 21 卷第 1期 Chin J Biologicals January 2008,Vo1.21 No.1 114.2 蔗糖密度梯度超速离心:蔗糖浓度 30%55%,离心条件 25 000 r/min,8 h。以核酸蛋白检测仪描记样品在 280 nm 处的吸收曲线,病毒液经离心后,直接血凝法检测效价,根据血凝滴度收集目的峰。115 病毒裂解将血凝效价为 1B2 560 的纯化病毒液分别加入Triton X-100 和去氧胆酸钠,获得浓度分别为 0.2%、0.5%和 0.8%的裂解溶液,于 1、2、3 和 4 h 分别取样,电镜观察病毒裂解效果。
11、116 卵清蛋白含量测定采用ELISA 双抗体夹心法,使用Serazym Ovalbu-min ELISA 试剂盒进行检测。117 血凝素含量测定采用免疫单扩散法1。将 100 Ll 抗体(NIBSC)加入到 1.5%、56e 的琼脂糖中,打孔,每孔直径为3 mm,每孔边距为 6 mm。将待检样品、标准品(NIB-SC)及对照品(NIBSC)室温裂解 40 min,每孔加入样品15 Ll,扩散 24 h,PBS 浸泡,晾干,考马斯亮蓝染色,脱色后观察结果。118 纯度测定采用HPLC 法。119 总蛋白测定采用 Lowry 法。1110 内毒素测定采用鲎试剂法。1111 稳定性试验疫苗于4e
12、保存 1 年后,测定其各项指标。于37e 保存 7、14、21、28 d,于 4e 保存 3、6、9、12、15、18个月,分别测定各型HA含量。21 结果211 病毒液纯化效果211.1 Sepharose 4FF 凝胶层析:收集洗脱峰 1、2,经血凝滴度和鉴别试验,确认病毒集中在峰1,见图 1。211.2 蔗糖密度梯度超速离心:收集洗脱峰1、2、3,经血凝滴度和鉴别试验,确认病毒集中在峰 2 中,见图2。第 1 峰为鸡胚卵清蛋白及小分子杂蛋白颗粒,第 2 峰为有结构的病毒颗粒,第 3峰为大分子杂蛋白,电镜下未见流感病毒颗粒。211.3 病毒液的纯度:高效液相色谱显示,出现完整的一个峰,未见
13、其他杂蛋白峰,在出样末端有微小波,计算病毒液纯度可达 85%以上。211.4 病毒液回收率:检测结果表明,不同方法纯化病毒后,鸡卵清蛋白和流感病毒峰分离效果显著,纯化效果较好。纯化前卵清蛋白含量为 25.5 L g/ml,凝胶层析和蔗糖密度梯度离心纯化后分别为 0.11和 0128 L g/ml,其去除率分别为 9915%和 9715%。蔗糖密度梯度离心和凝胶层析法的回收率分别为4210%和 3817%,见表 1。图 1 流感病毒 Sepharose 4FF凝胶层析图谱Fig11 Sepharose 4FF chromatographic profile of influenzavirus图
14、2 流感病毒蔗糖密度梯度超速离心图谱Fig 21 Sucrose density gradient ultracentrifugation profileof influenza virus212 不同裂解剂浓度和裂解时间的裂解效果比较A1、A3 和 B 株病毒纯化液在不同浓度裂解剂、不同裂解时间的HA 抗原含量和HA 裂解收率检测结果表明,Triton X-100 的裂解效果优于去氧胆酸钠。应用 Triton X-100,裂解剂终浓度为 0.5%或018%,裂解3或 4h 时,3 个型别病毒液裂解HA 收获率均达到了最高值(90%);不同型别病毒、裂解剂浓度和裂解时间的裂解效果大致相同,见表
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