基层培训免疫学技术 (2)讲稿.ppt
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1、基层培训免疫学技术第一页,讲稿共一百页哦临临床床免免疫疫检检验验是是运运用用免免疫疫学学基基本本的的基基本本原原理理和和技技术术,检检查查临临床床标标本本中中的的微微生生物物抗抗原原、肿肿瘤瘤抗抗原原以以及及相相应应的的微微生生物物抗抗体体、自自身身抗抗体体,为为感感染染性性性性疾疾病病、肿肿瘤瘤、自自身身免免疫疫病病以及免疫缺陷提供诊断依据。以及免疫缺陷提供诊断依据。第二页,讲稿共一百页哦免免疫疫检检验验分分为为两两个个部部分分,一一部部分分为为利利用用免免疫疫检检测测原原理理检检测测免免疫疫活活性性细细胞胞、抗抗原原、抗抗体体、补补体体、细细胞胞因因子子、细细胞胞粘粘附附分分子子等等免免疫
2、疫相相关关物物质质,另另一一部部分分是是利利用用免免疫疫检检测测原原理理检检测测体体液液中中微微量量物物质质如如激激素素、酶酶、血血浆浆微微量量蛋蛋白白、血血液液药药物物浓浓度度、微微量量元元素素等等。这这些些检检测测结结果果为为临临床床上上确确定定诊诊断断、分分析析病病情情、调调整整治治疗疗方方案案和和判判断断预预后后等等提提供供了了有有效效的的实实验依据。验依据。第三页,讲稿共一百页哦第一节第一节免疫学检验原理、特点和方法免疫学检验原理、特点和方法第四页,讲稿共一百页哦一、免疫学检验原理一、免疫学检验原理(一一)抗抗原原抗抗体体反反应应是是抗抗原原与与相相应应抗抗体体之之间间的的特特异异性
3、性结结合合反反应应。它它既既可可发发生生在在体体内内,也也可可发发生生在在体体外外。在在体体内内发发生生的的抗抗原原抗抗体体反反应应即即为为体体液液免免疫疫应应答答的的效效应应作作用用。体体外外的的抗抗原原抗抗体体结结合合反反应应,根根据据参参与与反反应应的的抗抗原原的的物物理理性性状状(可可溶溶性性或或颗颗粒粒性性)以以及及参参与与反反应应的的条条件件(电电解解质质、补补体体等等)不不同同,表表现现出出不不同同的的现现象象,如如沉沉淀淀、凝凝集集、细细胞胞溶溶解解、补补体体结结合合和和毒毒素素中中和和等等。一一般般将将检检查查血血清清中中病病原原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。微生物抗
4、原和抗体的试验称为血清学试验。第五页,讲稿共一百页哦抗抗原原抗抗体体反反应应可可分分为为两两个个阶阶段段。第第一一阶阶段段为为特特异异性性结结合合阶阶段段,此此阶阶段段仅仅需需数数秒秒至至数数分分钟钟,但但并并不不出出现现可可见见的的反反应应;第第二二阶阶段段为为可可见见反反应应阶阶段段,这这一一阶阶段段抗抗原原抗抗体体复复合合物物在在适适当当的的电电解解质质、pH、温温度度和和补补体体等等的的影影响响下下,进进一一步步交交联联聚聚集集,出出现现凝凝集集、沉沉淀淀、溶溶解解和和补补体体结结合合介介导导的的生生物物现现象象等等肉肉眼眼可可见见的的反反应应。第第二二阶阶段段反反应应较较慢慢,往往往
5、往需需要要数数分分钟钟至至数数小小时时。这这两两个个阶段不能严格划分,所需的时间也受多种因素的影响。阶段不能严格划分,所需的时间也受多种因素的影响。第六页,讲稿共一百页哦(二)抗原抗体反应的特点:(二)抗原抗体反应的特点:1、特异性、特异性抗抗原原抗抗体体反反应应的的特特异异性性(specificity)是是指指抗抗原原分分子子上上的的抗抗原原决决定定簇簇和和抗抗体体分分子子超超变变区区结结合合的的特特异异性性,由由这这两两个个分分子子之之间间空空间间结结构构的的互互补补性性决决定定的的。形形同同钥钥匙匙与与锁锁一一样样,所所以以抗抗原原抗抗体体的的结结合合是是有有高高度度特特异异性性的的。例
6、例如如白白喉喉抗抗抗抗毒毒素素只只能能与与相相应应的的外外毒毒素素结结合合,而而不不能能与与破破伤伤风风外外毒毒素素结结合合。因因此此,在在抗抗原原抗抗体体反反应应的的免免疫疫学学实实验验中中,可可以以用用已已知知的的抗抗原原或或抗抗体体来来检测特定的相对应的抗体或抗原。检测特定的相对应的抗体或抗原。第七页,讲稿共一百页哦2、比例性、比例性比比例例性性(proportionality)是是指指抗抗原原与与抗抗体体特特异异性性结结合合反反应应时时,生生成成肉肉眼眼可可见见结结合合物物的的量量与与反反应应物物浓浓度度的的关关系系,只只有有当当二二者者浓浓度度比比例例适适当当时时,才才出出现现可可见
7、见反反应应。抗抗原原抗抗体体分分子子比比例例合合适适的的范范围围,称称为为抗抗原原抗抗体体反反应应的的等等价价带带。在在此此范范围围抗抗原原抗抗体体结结合合充充分分,沉淀物形成得快而多。沉淀物形成得快而多。第八页,讲稿共一百页哦在在等等价价带带的的前前后后,由由于于抗抗体体和和抗抗原原的的过过量量,上上清清液液中中可可测测出出游游离离的的抗抗体体或或抗抗原原,形形成成的的沉沉淀淀物物少少。当当抗抗体体过过量量时时,称称为为前前带带,抗抗原原过过量量时时称称为为后后带带。因因此此,在在抗抗原原抗抗体体反反应应的的试试验验中中,如如果果没没有有产产生生肉肉眼眼可可见见的的抗抗原原抗抗体体复复合合物
8、物出出现现,一一方方面面要要考考虑虑是是否否有有抗抗原原与与相相应应的的抗抗体体存存在在,另另一一方方面面还还必必须须注注意意到到两两者反应的比例是否适当。者反应的比例是否适当。第九页,讲稿共一百页哦3、可逆性、可逆性抗抗原原与与相相应应抗抗体体结结合合成成复复合合物物后后,在在一一定定条条件件下下又又可可解解离离为为游游离离抗抗原原与与抗抗体体的的特特性性称称为为抗抗原原抗抗体体结结合合的的可可逆逆性性(reversibility)。由由于于抗抗原原抗抗体体的的结结合合是是分分子子表表面面的的非非共共价价键键结结合合,故故形形成成的的复复合合物物是是不不牢牢固固的的,在在一一定定的的条条件件
9、下下可可以以解解离离,所所以以说说抗抗原原抗抗体体结结合合形形成成抗抗原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。第十页,讲稿共一百页哦抗抗原原抗抗体体复复合合物物解解离离取取决决于于两两方方面面的的因因素素:一一是是抗抗体体对对相相应应抗抗原原的的亲亲和和力力;二二是是环环境境因因素素对对复复合合物物的的影影响响。亲亲和和力力高高的的抗抗体体与与抗抗原原表表位位在在空空间间构构型型上上非非常常适适合合,两两者者结结合合牢牢固固,不不容容易易解解离离,反反之之,亲亲和和力力低低的的抗抗体体与与抗抗原原形形成成的的复复合合物物较较易易解解离离。环环境境因因素素中中的的
10、过过高高或或过过低低均均可可破破坏坏离离子子间间的的静静电电引引力力,使使抗抗原原抗抗体体的的结结合合力力下下降降。增增加加离离子子强强度度,也也可可使使静静电电引引力力消消失失,降降低低抗抗原原抗抗体体的的结结合合力力,促促使使其其解解离离。解解离离后后的的抗抗原原和和抗抗体体仍仍然然保保持持游游离离抗抗原原、抗抗体体的的生生物物活性。活性。第十一页,讲稿共一百页哦(三)影响抗原抗体反应的因素(三)影响抗原抗体反应的因素影影响响抗抗原原抗抗体体反反应应的的因因素素较较多多,主主要要有有两两方方面面:一一是是反反应应物物自自身身的的因因素素,另另一一方方面面是是反应环境的因素。反应环境的因素。
11、第十二页,讲稿共一百页哦1、反应物自身因素、反应物自身因素(1)抗原)抗原抗抗原原的的理理化化性性状状、表表面面抗抗原原决决定定簇簇的的种种类类和和数数目目均均可可影影响响抗抗原原抗抗体体反反应应的的结结果果。如如颗颗粒粒性性抗抗原原与与相相应应抗抗体体结结合合后后产产生生凝凝集集现现象象;可可溶溶性性抗抗原原与与相相应应抗抗体体结结合合后后产产生生沉沉淀淀现现象象;单单价价抗抗原原与与相相应应抗抗体体结结合合后后不出现沉淀现象。不出现沉淀现象。第十三页,讲稿共一百页哦(2)抗体)抗体来来源源来来源源于于不不同同动动物物的的免免疫疫血血清清,其其反反应应性性有有差差异异。家家兔兔等等大大多多数
12、数动动物物的的免免疫疫血血清清,由由于于具具有有较较宽宽的的等等价价带带,与与相相应应抗抗原原结结合合易易出出现现可可见见的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物。马马、人人的的免免疫疫血血清清等等价价带带窄窄,抗抗原原不不足足或或过过剩剩,均均易易形形成成可可溶溶性性复复合合物物。单单克克隆隆抗抗体体一一般般不不适适合合用用于于凝集和沉淀反应。凝集和沉淀反应。第十四页,讲稿共一百页哦浓浓度度抗抗体体的的浓浓度度往往往往是是与与抗抗原原相相对对而而言言,二二者者合合适适的浓度才易出现可见的反应结果。的浓度才易出现可见的反应结果。特异性和亲和力特异性和亲和力特异性与亲和力是影响抗原抗特异性与亲和力是影响
13、抗原抗体反应的关键因素,它们共同影响试验结果的准确体反应的关键因素,它们共同影响试验结果的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、高亲和力的程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、高亲和力的抗体,才能提高试验的可靠性。抗体,才能提高试验的可靠性。第十五页,讲稿共一百页哦2、反应的环境条件、反应的环境条件(1)电解质)电解质抗抗原原抗抗体体结结合合后后,由由亲亲水水性性向向疏疏水水性性转转换换过过程程中中必必须须要要有有电电解解质质参参与与才才能能进进一一步步使使抗抗原原抗抗体体复复合合物物表表面面失失去去电电荷荷,破破坏坏水水化化层层,使使复复合合物物相相互互靠靠拢拢聚聚集集,形形成成大大块块凝凝集集
14、、沉沉淀淀。若若无无电电解解质质存存在在,则则不不出出现现可可见见反反应应。在在抗抗原原抗抗体体反反应应中中,通通常常使使用用0.85%NaCl溶溶液液或或各各种种缓缓冲冲液液作作抗抗原原抗抗体体的稀释液及反应液。的稀释液及反应液。第十六页,讲稿共一百页哦(2)酸碱度)酸碱度抗抗原原抗抗体体反反应应必必须须在在合合适适的的pH环环境境中中进进行行,pH过过低低或或过过高高都都会会影影响响抗抗原原抗抗体体的的反反应应。抗抗原原抗抗体体反反应应中中一一般般以以pH69为为宜宜。有有补补体体参参与与的的反反应应pH为为7.27.4,超过这个范围会降低补体的酶活性而影响反应。,超过这个范围会降低补体的
15、酶活性而影响反应。第十七页,讲稿共一百页哦(3)温度)温度抗抗原原抗抗体体反反应应需需要要合合适适的的温温度度才才有有利利于于二二者者结结合合。一一般般以以1540为为宜宜,最最适适温温度度为为37。在在此此范范围围内内,温温度度越越高高,抗抗原原抗抗体体分分子子运运动动越越快快,碰碰撞撞接接触触机机会会越越多多,两两者者结结合合反反应应速速度度越越快快。但但是是如如果果温温度度高高于于56,会会导导致致抗抗原原抗抗体体复复合合物物解解离离,甚甚至至分分子子变变性性。温温度度越越低低,反反应应速速度度越越缓缓慢慢,但但抗抗原原抗抗体结合越牢固,易于观察。体结合越牢固,易于观察。第十八页,讲稿共
16、一百页哦(4)振荡)振荡在在抗抗原原抗抗体体反反应应中中,适适当当的的振振摇摇可可促促使使抗抗原抗体分子的接触,原抗体分子的接触,加速其反应加速其反应。第十九页,讲稿共一百页哦(四)抗原抗体反应的类型(四)抗原抗体反应的类型随随着着免免疫疫学学技技术术的的飞飞速速发发展展,在在原原有有经经典典免免疫疫学学实实验验方方法法基基础础上上,新新的的免免疫疫学学测测定定方方法法不不断断出出现现,使使免免疫疫学学实实验验技技术术更更特特异异、更更敏敏感感和和更更稳稳定定。目目前前根根据据抗抗原原和和抗抗体体的的性性质质不不同同,反反应应出出现现的的现现象象和和结结果果的的不不同同,以以及及反反应应时时参
17、参与与的的其其他他条条件件不不同同,将将抗抗原原抗体反应分为五种类型。抗体反应分为五种类型。第二十页,讲稿共一百页哦(1)可可溶溶性性抗抗原原与与相相应应抗抗体体结结合合产产生生的的沉沉淀淀反反应应;(2)颗颗粒粒抗抗原原与与相相应应抗抗体体结结合合发发生生的的凝凝集集反反应应;(3)抗抗原原抗抗体体结结合合后后激激活活补补体体所所产产生生的的溶溶细细胞胞反反应应;(4)细细菌菌外外毒毒素素或或病病毒毒与与相相应应抗抗体体结结合合所所致致的的中中和和反反应应;(5)标标记记免免疫疫的的抗抗原原抗抗体体反反应应。每每种种反反应应类类型型都都包包括括若若干干实实验验技技术术。(见见抗抗原原抗抗体体
18、反列应表反列应表1)第二十一页,讲稿共一百页哦表表1抗原抗体反应的类型和试验方法抗原抗体反应的类型和试验方法-反应类型反应类型实验方法实验方法结果判断结果判断-沉淀反应沉淀反应液相沉淀实验液相沉淀实验观察沉淀、检测浊度观察沉淀、检测浊度琼脂凝胶扩散琼脂凝胶扩散观察和测定扫描沉淀线或环观察和测定扫描沉淀线或环凝胶电泳技术凝胶电泳技术观察和测定扫描沉淀峰弧等观察和测定扫描沉淀峰弧等凝集反应凝集反应直接凝集实验直接凝集实验 用裸眼、放大镜或显微镜观察红用裸眼、放大镜或显微镜观察红细胞或胶乳颗粒的凝集现象细胞或胶乳颗粒的凝集现象间接凝集实验间接凝集实验 同上同上凝集抑制实验凝集抑制实验同上同上协同凝集
19、实验协同凝集实验同上同上抗球蛋白实验抗球蛋白实验同上同上-第二十二页,讲稿共一百页哦-补体参与反应补体参与反应 补体溶血实验补体溶血实验以裸眼或光电比色仪观察以裸眼或光电比色仪观察测定溶血现象测定溶血现象补体结合实验补体结合实验 同上同上中和反应中和反应病毒中和实验病毒中和实验 病毒感染性丧失病毒感染性丧失毒素中和实验毒素中和实验 外毒素毒性丢失外毒素毒性丢失标记免疫标记免疫荧光免疫技术荧光免疫技术检测荧光检测荧光放射免疫技术放射免疫技术 检测放射性检测放射性酶标免疫酶标免疫检测酶底物显色、发光、荧光检测酶底物显色、发光、荧光发光免疫技术发光免疫技术检测发光检测发光金标免疫技术金标免疫技术观察
20、金颗沉淀线观察金颗沉淀线-第二十三页,讲稿共一百页哦二、免疫学检验方法和应用二、免疫学检验方法和应用(一)凝集反应(一)凝集反应颗颗粒粒性性抗抗原原或或可可溶溶性性抗抗原原(或或抗抗体体)与与载载体体颗颗粒粒结结合合成成致致敏敏颗颗粒粒后后,与与相相应应抗抗体体(或或抗抗原原)发发生生特特异异性性反反应应,在在适适当当电电解解质质存存在在下下,形形成成肉肉眼眼可可见见的的凝凝集集现现象象,称称为为凝凝集集反反应应。凝凝集集试试验验应应用用广广而而且且敏敏感感度度高高,方方法法简简便便,迄迄今今已已成成为为通通用用的的免免疫疫学学技技术术之之一一,广广泛泛用用于于细细菌菌的的鉴鉴定定和和分分型型
21、、抗抗原原分分析析、测测定定抗抗体体和和诊诊断断疾疾病病等等临临床床检检验验。在在免免疫疫检检验验技技术术中中,根根据据参参与与反反应应的的颗颗粒粒的的不不同同,把把凝凝集集反反应应分分为为直直接接凝凝集集反反应应和和间间接接凝凝集集反反应应。而而自自身身红红细细胞胞凝凝集集反反应应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。第二十四页,讲稿共一百页哦1、直接凝集反应:、直接凝集反应:细细菌菌、螺螺旋旋体体和和红红细细胞胞等等颗颗粒粒性性抗抗原原,在在适适当当电电解解质质参参与与下下可可直直接接与与相相应应抗抗体体反反应应,当当二二者者比
22、比例例适适当当时时,出出现现凝凝集集,称称为为直直接接凝凝集集反反应应。反反应应中中的的抗抗原原称称为为凝凝集集原原,参参与与反反应应的的抗抗体体称称为为凝凝集集素素。常常用用的的凝凝集集试试验验有有玻玻片片法法、试试管管法法和和微微量量血血凝凝反反应板法。应板法。第二十五页,讲稿共一百页哦(1)玻玻片片凝凝集集试试验验:多多用用于于定定性性。用用以以知知抗抗体体诊诊断断血血清清与与受受检检菌菌液液在在玻玻片片上上混混匀匀,放放置置数数分分钟钟后后如如抗抗体体与与相相应应抗抗原原反反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌玻片凝集试验。应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌玻片凝集试验。(2)试试管
23、管凝凝集集试试验验:多多用用于于半半定定量量和和定定量量试试验验,常常用用已已知知一一定定量量的的抗抗原原(细细菌菌、细细胞胞等等)与与一一系系列列稀稀释释的的病病人人血血清清混混合合,在在保保温温放放置置后后观观察察结结果果,判判定定受受检检血血清清有有无无相应抗体以及效价,如肥达反应。相应抗体以及效价,如肥达反应。第二十六页,讲稿共一百页哦2、间间接接凝凝集集反反应应:将将可可溶溶性性抗抗原原(或或抗抗体体)先先吸吸附附或或偶偶联联与与免免疫疫无无关关大大小小适适当当的的颗颗粒粒表表面面,使使之之成成为为致致敏敏载载体体颗颗粒粒,然然后后与与相相应应抗抗体体(或或抗抗原原)作作用用,在在适
24、适宜宜的的电电解解质质存存在在条条件件下下,出出现现特特异异性性的的凝凝集集现现象象,称称为为间间接接凝凝集集反反应应。其其敏敏感感度度比比直直接接凝凝集集反反应应高高28倍倍,亦亦明明显显高高于于沉沉淀淀反反应应。在在临临床床上上广广泛泛用用于于各各种种抗抗体体和和可可溶溶性性抗抗原原的的检检测测。间接凝集反应试验可分为:间接凝集反应试验可分为:第二十七页,讲稿共一百页哦(1)间间接接凝凝集集试试验验:用用抗抗原原致致敏敏载载体体以以检检测测标标本本中中的的相相应应抗抗体体。将将可可溶溶性性抗抗原原与与载载体体颗颗粒粒结结合合,再再与与样样品品中中的的抗抗体体反反应应,形形成成肉肉眼眼可可见
25、见的的凝凝集集颗颗粒粒或或凝集块者为阳性。凝集块者为阳性。第二十八页,讲稿共一百页哦(2)反反向向间间接接凝凝集集试试验验:用用已已知知特特异异性性抗抗体体致致敏敏载载体体以以检检测测标标本本中中的的相相应应抗抗原原。临临床床上上用用于于检测检测HbsAg、AFP等。等。第二十九页,讲稿共一百页哦(3)间接抑制试验:试剂为已知抗原致敏的颗粒)间接抑制试验:试剂为已知抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体,用于检测标本中与致敏抗原载体和相应的抗体,用于检测标本中与致敏抗原相同的抗原。检测方法是将标本与抗体试剂混合相同的抗原。检测方法是将标本与抗体试剂混合反应,然后加入致敏载体,若出现凝集,说明标反应,然
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