高通量测序技术第二代测序技术.pdf
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1、高通量测序技术第二代测序技术 高通量测序技术第二代测序技术 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。自从 2005 年 454 Life Sciences公司(2007 年该公司被 Roche 正式收购)推出了 454 FLX焦磷酸测序平台(454 FLX pyrosequencing platform)以
2、来,曾推出过3730 xl DNA测序仪(3730 xl DNA Analyzer)的 Applied BioSystem(ABI)这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了,因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列(series capillary array electrophoresis sequencing machines)遇到了两个强有力的竞争对手,一个就是罗氏公司(Roche)的 454 测序仪(Roch GS FLX sequencer),另一个就是2006 年美国 Illumina公司推出的Solexa 基因组分析平台(Genome Analyzer pla
3、tform),为此,2007 年 ABI 公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。(见表一)公司名称 技术原理 技术开发者 商业模式 Apply Biosystems(ABI)基于磁珠的大规模并行克隆连接DNA 测序法 美国Agencourt私人基)上市公司:因组学公司(APG 销售设备和试剂获取利润 Illumina 合成测序法 英国 Solexa 公司首席科学家 David Bentley 上市公司:销售设备和试剂获取利润 Roche 大规模并行焦磷酸合成测序法 美国 454 Life Sciences
4、公司的创始人Jonathan Rothberg 上市公司:销售设备和试剂获取利润 Helicos 大规模并行单分子合成测序法 美国斯坦福大学生物工程学家 Stephen Quake 上市公司:2007 年 5 月首次公开募股(IPO)Complete Genomics DNA 纳米阵列与组合探针锚定连接测序法 美国 Complete Genomics 公司首席科学家 radoje drmanac 私人公司:投资额为 4650 万美元 表一:主流测序平台一览 这些平台共同的特点是极高的测序通量,相对于传统测序的 96 道毛细管测序,高通量测序一次实验可以读取 40 万到 400 万条序列。读取长
5、度根据平台不同从 25bp 到 450bp,不同的测序平台在一次实验中,可以读取 1G 到 14G 不等的碱基数,这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。尽管如此,在这项新的划时代的测序技术刚出现的时候,科学界对这项新技术却并不热衷。许多习惯用桑格技术的科学家怀疑新技术的准确度、阅读能力、成本消费、实用性。代理 Sanger 型测序硬件的经销商害怕其投资失败而首先提出了这些怀疑。图一:在芯片上进行的测序:Illumina 测序平台 然而大多数人却忽略了一个事实,即桑格技术的普及最初也遇到同样的阻碍。桑格技术刚开发出来时,阅读能力很难超过 25bp,即使在 Fred Sanger 双脱氧终止
6、法发明后也只达到 80bp,如今却达到了 750bp;而新发展的合成测序技术,应用焦磷酸测序方法,其阅读能力最初只有 100bp,推向市场 16 个月后增加至 250bp,随着技术的不断完善,目前已达到了 400bp,很快就接近桑格技术目前的水平。除了阅读能力外,能否以有限的成本用一台仪器产生足够数量的序列标记也是另一个需要改善的重要问题。这个问题已经被 Roche 公司解决了,应用他们的系统,仅花费阅读 35bp 或者更小片段的成本就能产生比 35bp 多 10 倍的序列标记。图二:GS FLX 高通量测序方法原理示意图 一、高通量测序的应用 高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤
7、,避免了亚克隆过程中引入的偏差。依靠后期强大的生物信息学分析能力,对照一个参比基因组(reference genome)高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence),2007 年 van Orsouw 等人结合改进的 AFLP 技术和 454 测序技术对玉米基因组进行了重测序,该重测序实验发现的超过 75%的 SNP 位点能够用 SNPWave技术验证,提供了一条对复杂基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线。2008 年 Hillier 对线虫 CB4858 品系进行 Solexa 重测序,寻找线虫基因组中的 SNP 位点和单位点的缺失或扩增。
8、但是也应该看到,由于高通量测序读取长度的限制,使其在对未知基因组进行从头测序(novo sequencing)的应用受到限制,这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到 850 碱基)的协助。但是这并不影响高通量测序技术在全基因组 mRNA 表达谱,microRNA 表达谱,ChIP-chip 以及 DNA 甲基化等方面的应用。2008 年 Mortazavi 等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了 RNA 深度测序,这项工作展示了深度测序在转录组研究上的两大进展,表达计数和序列分析。对测得的每条序列进行计数获得每个特定转录本的表达量,是一种数码化的表达谱检测,能检测到丰度非常低的转录本。分析测得
9、的序列,有大于 90%的数据显示落在已知的外显子中,而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是从未被报道过的 RNA 剪切形式,3端非翻译区,变动的启动子区域以及潜在的小 RNA 前体,发现至少有 3500 个基因拥有不止一种剪切形式。而这些信息无论使用芯片技术还是 SAGE 文库测序都是无法被发现的。高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子 RNA 或非编码 RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列,高度同源),而且小分子 RNA 的短序列正好配合了高通量测序的长度,使得数据“不浪费”,同时测序方法还能在实验中发现新的小分子 RNA。在衣
10、藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的 小分子 RNA。在线虫中获得了 40 万个序列,通过分析发现了 18 个新的小 RNA分子和一类全新的小分子 RNA。在 DNA蛋白质相互作用的研究上,染色质免疫沉淀深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色质免疫沉淀以后的 DNA 直接进行测序,对比 ref seq 可以直接获得蛋白与 DNA 结合的位点信息,相比 ChIP-chip,ChIP-seq 可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。图 三:Independent Flow Cells(SoLidTM Syste
11、m)二、高通量测序的前景 目前,大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的芯片测序技术。不过,有些分析家也的确认为芯片测序技术正面临着挑战,他们认为到了2012 年新一代的测序技术将会带来高达 2。15 亿美元的产值。2006 年,整个芯片测序市场大概价值 8 亿美元,其中 65%的市场份额都是有关基因表达谱分析产品的,剩下 35%的市场份额则由基因型分析芯片占据。不过美国哈佛大学(Harvard University)遗传学教授 George Church 认为,这部分市场也会受到新一代测序技术的冲击。重测序芯片(resequencing arrays)、单核苷酸多态性分析芯片以及基
12、因拷贝数目变异分析芯(copy number variant array)市场也会受到影响。也有分析家不赞同这个观点,他们认为即使新一代测序技术很便宜,还是有不少人会选择传统的测序仪的。新一代测序技术相对传统芯片测序技术的优势,最终还得依靠广告和市场营销手段的推广才能获得大众的认可。去年夏天,由 Frost&Sullivan 公司对学术科研机构和私人研究团体进行的一项调查研究结果表明,在实际应用领域,例如进行表达谱分析时,人们还是倾向于选择传统的芯片产品,而并非青睐新一代的测序产品。新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。平均采购一台新一代测序仪大约要花费 50 万美元,除非该实验室测序的工
13、作量非常大,否则是不会考虑购买的。即使像 Polonator 这样的新一代测序仪也需要花费 15 万美元左右,这笔费用对于一个小实验室来说是无法承受的。这时,只需要 150 美元一块的芯片就非常有竞争力了。以基因芯片产品享誉业界的美国 Affymetrix 公司市场部副总裁 Jay Kaufman 认为,新一代测序技术对于芯片市场来说的确会带来一定的冲击,不过要完全取代表达谱分析芯片还需要一定的时间。但是,基因芯片也有其自身的缺点,就在于它是一个“封闭系统”,它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变异)。而高通量测序的强项,就在于它是一个“开放系统”,它的发现能力和寻找新的信息的能力,从本质上
14、高于芯片技术。研究者可以充分享受这两个平台的比较优势,在获取新信息的基础上,利用芯片的强项,即对已知信息的高通量、低成本(相对)的检测能力,对大量样品进行快速检测,短时间内获得有大量有效的数据。作为两个高通量的基因组学研究技术,在应用的某些方面存在重叠和竞争,但是在更多方面是优势互补,两种方法联合使用,将解决以前的单种技术难以解决的问题。三、结语 新一代测序已显示出巨大的潜力。也正是因为科学的不断进步,在给测序技术提出新要求的时候,也给这项技术带来了新的增长点:2008 年 4 月 Helico BioScience 公司的 Timothy 等人在 Science 上报道了他们开发的真正的单分
15、子测序技术,也被称为第三代测序技术,并利用该技术对一个M13 病毒基因组进行重测序。这项技术之所以被称为真正的单分子测序,是因为它完全跨过了上述 3 种高通量测序依赖的基于 PCR 扩增的信号放大过程,真正达到了读取单个荧光分子的能力,向 1000 美元测定一个人类基因组的目标迈出了一大步。教你如何用 WORD 文档(2012-06-27 192246)转载?标签:杂谈 1.问:WORD 里边怎样设置每页不同的页眉,如何使不同的章节显示的页眉不同,答:分节,每节可以设置不同的页眉。文件页面设置版式页眉和页脚首页不同。2.问:请问 word 中怎样让每一章用不同的页眉,怎么我现在只能用一个页眉,
16、一改就全部改了,答:在插入分隔符里,选插入分节符,可以选连续的那个,然后下一页改页眉前,按一下“同前”钮,再做的改动就不影响前面的了。简言之,分节符使得它们独立了。这个工具栏上的“同前”按钮就显示在工具栏上,不过是图标的形式,把光标移到上面就显示出”同前“两个字来。3.问:如何合并两个 WORD 文档,不同的页眉需要先写两个文件,然后合并,如何做,答:页眉设置中,选择奇偶页不同与前不同等选项。4.问:WORD 编辑页眉设置,如何实现奇偶页不同 比如:单页浙江大学学位论文,这一个容易设;双页:(每章标题),这一个有什么技巧啊,答:插入节分隔符,与前节设置相同去掉,再设置奇偶页不同。5.问:怎样使
17、 WORD 文档只有第一页没有页眉,页脚,答:页面设置,页眉和页脚,选首页不同,然后选中首页页眉中的小箭头,格式,边框和底纹,选择无,这个只要在“视图”“页眉页脚”,其中的页面设置里,不要整个文档,就可以看到一个“同前”的标志,不选,前后的设置情况就不同了。6.问:如何从第三页起设置页眉,答:在第二页末插入分节符,在第三页的页眉格式中去掉同前节,如果第一、二页还有页眉,把它设置成正文就可以了?在新建文档中,菜单视图页脚插入页码页码格式起始页码为 0,确定;?菜单 首页不同,确定;?将光标放到第一页末,菜单文件页面设置文件页面设置版式 版式首页不同应用于插入点之后,确定。第 2 步与第三步差别在
18、于第 2 步应用于整篇文档,第 3 步应用于插入点之后。这样,做两次首页不同以后,页码从第三页开始从 1 编号,完成。7.问:WORD 页眉自动出现一根直线,请问怎么处理,答:格式从“页眉”改为“清除格式”,就在“格式”快捷工具栏最左边;选中页眉文字和箭头,格式,边框和底纹,设置选无。8.问:页眉一般是-,上面写上题目或者其它,想做的是把这根线变为双线,WORD 中修改页眉的那根线怎么改成双线的 答:按以下步骤操作去做:?选中页眉的文字,包括最后面的箭头?格式,边框和底纹?选线性为双线的?在预览里,点击左下小方块,预览的图形会出现双线?确定?上面和下面自己可以设置,点击在预览周围的四个小方块,
19、页眉线就可以在不同的位置。9.问:Word 中的脚注如何删除,把正文相应的符号删除,内容可以删除,但最后那个格式还在,应该怎么办,答:步骤如下:1、切换到普通视图,菜单中“视图”“脚注”,这时最下方出现了尾注的编辑栏。2、在尾注的下拉菜单中选择“尾注分隔符”,这时那条短横线出现了,选中它,删除。3、再在下拉菜单中选择“尾注延续分隔符”,这是那条长横线出现了,选中它,删除。4、切换回到页面视图。尾注和脚注应该都是一样的。10.问:Word 里面有没有自动断词得功能常常有得单词太长了,如果能设置下自动断词就好了 答:在工具语言断字自动断字,勾上,word 还是很强大的。11.问:如何将 word
20、文档里的繁体字改为简化字,答:工具语言中文简繁转换。12.问:怎样微调 WORD 表格线,WORD 表格上下竖线不能对齐,用鼠标拖动其中一条线,可是一拖就跑老远,想微调表格竖线让上下对齐,请问该怎么办,答:选定上下两个单元格,然后指定其宽度就可以对齐了,再怎么拉都行pressAlt,打开绘图,其中有个调整坐标线,单击,将其中水平间距与垂直间距都调到最小值即可。打开绘图,然后在左下脚的绘图网格里设置,把水平和垂直间距设置得最小。13.问:怎样微调 word 表格线,我的 word 表格上下竖线不能对齐,用鼠标拖动其中一条线,可是一拖就跑老远,我想微调表格竖线让上下对齐,请问该怎么办,答:可以如下
21、操作:?按住 ctl 键还是 shift,你 have a try?double click the line,try it)?打开绘图,设置一下网格(在左下角)。使水平和垂直都为最小,试一把,?press Alt 14.问:怎么把 word 文档里已经有的分页符去掉,答:先在工具 选项 视图 格式标记,选中全部,然后就能够看到分页符,delete 就 ok 了。15.问:Word 中下标的大小可以改的吗 答:格式字体 16.问:Word 里怎么自动生成目录啊 索引和目录 答:用“格式样式和格式”编辑文章中的小标题,然后插入-17.问:Word 的文档结构图能否整个复制 论文要写目录了,不想再
22、照着文档结构图输入一遍,有办法复制粘贴过来吗,答:可以自动生成的,插入索引目录。18.问:做目录的时候有什么办法时右边的页码对齐,比如:1.1 标题.11.2 标题.2 答:画表格,然后把页码都放到一个格子里靠右或居中,然后让表格的线条消隐就可以了,打印出来就很整齐。19.问:怎样在 word 中将所有大写字母转为小写,比如一句全大写的转为全小写的答:格式-更改大小写-小写 20.问:在存盘的时候,出现了问题,症状如下:磁盘已满或打开文件过多,不能保存,另开新窗口重存也不管用。如何解决,答:把 word 文档全选,然后复制,然后关掉 word,电脑提示你粘贴板上有东西,要不要用于别的程序,选是
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- 通量 技术 第二代
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