DNA重组酶切和连接.pptx
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1、预实验结果预实验结果载体载体()()1 2 3PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳(的琼脂糖电泳(1%1%)Lane1Lane1:sample 1 sample 1 Lane2Lane2:sample 2 sample 2 Lane3Lane3:sample 3 sample 3 一条带一条带第1页/共29页杂带杂带预实验结果预实验结果PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳(的琼脂糖电泳(1%1%)Lane1Lane1:sample 1 sample 1 Lane2Lane2:sample 2 sample 2 Lane3Lane3:sam
2、ple 3 sample 3 两条带两条带三条带三条带DNADNA分子的大小分子的大小琼脂糖浓度琼脂糖浓度DNADNA分子构象分子构象染色剂的量染色剂的量电压电压缓冲液的组成缓冲液的组成缓冲液离子强度缓冲液离子强度等等等等分子克隆上册分子克隆上册,第五章第五章一条带一条带 1 2 3第2页/共29页我们的结果我们的结果PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳(的琼脂糖电泳(1%1%)Lane1Lane1:MarkerMarker;Lane2Lane2:sample 1;sample 1;Lane3:sample 2;Lane4:sample 31 215000bp100
3、00bp7500bp5000bp2500bp1000bp250bp3 4第3页/共29页我们的结果我们的结果质优量少,成功率低质优量少,成功率低质优量足质优量足卫星菌落?卫星菌落?第4页/共29页我们的结果我们的结果?电泳行为异常电泳行为异常?第5页/共29页我们的结果我们的结果可用可用电泳:尽量减少上样时间,减少扩散;电泳:尽量减少上样时间,减少扩散;样品尽量均匀分布于胶孔中;样品尽量均匀分布于胶孔中;尽量远离边缘泳道尽量远离边缘泳道第6页/共29页Q&A关于实验中的安全问题关于实验中的安全问题关于酚关于酚-氯仿氯仿-异戊醇异戊醇分层问题:下层分层问题:下层作用问题:酚变性蛋白作用问题:酚变
4、性蛋白 氯仿去除脂类,除酚氯仿去除脂类,除酚 异戊醇消泡,减少表面张力剪切异戊醇消泡,减少表面张力剪切关于酚:关于酚:下层;下层;氧化判断氧化判断 第7页/共29页基因重组基因重组酶切和连接酶切和连接 基因的克隆与表达专题之三基因的克隆与表达专题之三第8页/共29页第9页/共29页剪切剪切5NNGOH pGATCCNN33NNCCTAGp HOGNN5 BamHHind+第10页/共29页引物引物1 1 5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC 3 CDS CDS 5AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT .AKP CDS.CDSCD
5、S .CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3引物引物2 2 3GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5BamH1HindpETBlue-2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT引物引物1 1:5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3 BamH 引物引物2 2:5GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3 Hind第11页/共29页5pApCpGoH pApApTpTpCpGpT3 3TpGpCpTpTpApAp oHG pCpAp55pApCpGp
6、ApApTpTpCpGpT33TpGpCpTpTpApApGpCpAp5Mg2+ATP T4DNA连接酶连接酶连接连接第12页/共29页pETBlue-2 3.653kb酶酶 切切连连 接接酶酶 切切pETBlue-AKP(5.2kb)pETBlue-2 3.653kb转化转化复苏复苏 pETBlue-AKP AKPpETBlue-pETBlueAKPAKP第13页/共29页u 酶切:酶切:37370 0C C,水浴酶切,水浴酶切3 3小时小时(封口膜封口)封口膜封口)u 酶切产物的纯化和盒回收:酶切产物的纯化和盒回收:直接进行液体回收:直接进行液体回收:每每100uL100uL溶液加入溶液加
7、入500uL500uL溶胶液,其余的操作步骤同前。溶胶液,其余的操作步骤同前。向柱子的向柱子的正中央正中央 共共加加20uL20uL洗脱洗脱bufferbuffer,其余步骤同前。其余步骤同前。酶酶 切切 反反 应应 体体 系系管号管号核酸核酸10 xbufferK10 xbufferKddHddH2 2O OBamHIBamHIHandIIIHandIIItube1tube1目的基因目的基因 AKP AKP 24 uL24 uL3 uL3 uL0 uL0 uL2 uL2 uL1 uL1 uLtube2tube2pETBlue-2 pETBlue-2 10 uL10 uL 2 uL2 uL5
8、uL5 uL2 uL2 uL1 uL1 uL实验操作酶切实验操作酶切每每人人做做一一至至两两份份第14页/共29页胶回收原理胶回收原理硅基质材料:硅基质材料:小片段双链小片段双链DNADNA高盐环境与其吸附高盐环境与其吸附 低盐环境与其解离低盐环境与其解离第15页/共29页 每每100uL100uL溶液加入溶液加入500uL500uL溶胶液溶胶液,混匀。混匀。将液体转移至吸附柱,将液体转移至吸附柱,12000rpm12000rpm离心离心3030秒,去除废液秒,去除废液漂洗漂洗:向吸附柱的向吸附柱的正中央正中央加入加入500uL500uL漂洗液,漂洗液,12000rpm12000rpm离心离心
9、3030秒,去除废液。秒,去除废液。重复一次。重复一次。空柱空柱12000rpm12000rpm离心离心2min2min,以彻底去除废液,以彻底去除废液将吸附柱置于一新的干净将吸附柱置于一新的干净无菌的无菌的mLEPmLEP管中,向吸附柱的管中,向吸附柱的正正中央中央加加15uL15uL无菌水,室温放置无菌水,室温放置5 5分钟。分钟。12000rpm12000rpm离心离心3030秒,秒,以洗脱以洗脱DNADNA。再次向柱子的再次向柱子的正中央正中央加加5uL5uL无菌水,室温放置无菌水,室温放置5 5分钟;分钟;12000rpm12000rpm离心离心2 2分钟。分钟。合并回收液合并回收液
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- 关 键 词:
- DNA 重组 连接
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