DNA 酶切、回收和连接.ppt
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1、 实验七实验七 基因片段的亚克隆基因片段的亚克隆(DNA(DNA的酶切、回收和连接的酶切、回收和连接)一一.实验目的实验目的1.掌握DNA酶切的基本原理。2.学习和了解限制性内切酶的使用方法。3.学习和掌握DNA片段胶回收的方法 二二.实验原理实验原理 1.核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶,它们的功能类似于高等动物的免疫系统,用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶,它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键,产生的DNA片段5端为P,3端为OH。由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割,因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲
2、基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。2.DNA2.DNA的酶切反应的酶切反应分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链DNA分子中特定的靶序列(48bp),并在该序列内切断DNA,形成特有的粘末端或平端。3.DNA的连接的连接在T4DNA连接酶的作用下,平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步:T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3羟基切口的DNA分子上,使DNA腺苷化。产生一个新的磷酸二酯键,把缺口封起来。三三.试剂与器材试剂与器材一一试剂试剂1.限制性内切酶EcoRI,H
3、indIII;10内切酶缓冲液2.T4DNA连接酶;10连接酶缓冲液3.电泳缓冲液(0.5TBE或1TAE)4.琼脂糖;溴酚兰;溴化乙锭(工作浓度0.5g/ml)5.酚;氯仿;无水乙醇;70%乙醇;灭菌双蒸水Note:1.Concentration:20,000and100,000units/ml.AssayedonlambdaDNA2.StorageConditions:250mMNaCl,10mMTris-HCl(pH7.4),0.1mMEDTA,1mMdithiothreitol,0.5mg/mlBSA,and50%glycerol.Storeat-20C3.DiluentCompati
4、bility:DiluentB4.HeatInactivation:65Cfor20minutes5.Notsensitivetodam,dcmormammalianCpGmethylation6.Conditionsoflowionicstrength,highenzymeconcentration,glycerolconcentration5%orpH8.0mayresultinstar activity双酶切双酶切buffer的选用的选用二二实验器材实验器材1电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备2恒温水浴槽 四.操作步骤1.酶切反应设计酶切体积为2030l,计算清楚酶切系统中各成分的用量
5、,清晰做好记录,如果是同一条件下进行多个酶切反应,建议统一加好共同的组分后,分装;先加入正确体积的无菌双蒸水,加入1/10体积的10 x酶切缓冲液,混匀;在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶;加入适量的DNA样品;弹匀,短暂离心;置所用限制性内切酶最适温度水浴中,酶切13小时,酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积,以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大;置65水浴中10分钟,对限制性内切酶进行灭活,不同的酶灭活条件可能不同,请参照说明书进行;进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果;反应体系:10内切酶缓冲液2lDNA1-1.5g限制性内切酶2-5单位用灭菌的ddH2O补至20l,371小时
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