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1、色谱柱的选择大多数化合物是可以使用C18柱分离C18优点:柱便宜,流动相便宜,使用时间长,易于通过改变流动相得到最佳分离,药品本身具有纯度高的特点,容易分离,辅料和分解产物是分离的难点。比中药成分的分离,体液中药物成分的分离,微量成分的分离,杂质成分的分离,食品中药物残留的分离简单的多。第1页/共29页选择色谱条件的方法 1查文献,学习别人的方法2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件3自己积累药物分析的色谱条件,从中寻找规律,尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下,自己摸索色谱条件第2页/共29页色谱
2、柱的分类 1根据担体材料分类(1)硅胶型:SiO2;C18;C1三甲基;C2;C4;C8;CN;NH2;苯基(2)聚合物型:聚苯乙烯类(离子交换;凝胶色谱柱);聚丙烯酸酯(离子交换);聚乙烯醇:C18;离子交换(3)钛柱:比硅胶型的稳定性提高(4)其它类型第3页/共29页色谱柱的分类2.根据分离方式分类(1)正相:SiO2;CN;NH2;苯基(2)反相:C18;C1三甲基;C2;C4;C8;CN;NH2;苯基(3)离子交换:弱碱阴离子交换;弱酸阳离子交换 强碱阴离子交换;强酸阳离子交换(4)凝胶过滤:水溶性凝胶过滤;油溶性凝胶过滤(5)其它类型:手性柱等第4页/共29页色谱柱的分类3.根据色谱
3、柱尺寸分类(1)10cm50cm内径为制备柱(2)4cm8cm内径为标准柱(3)3cm一下内径为小孔柱或微孔柱和毛细管柱(4)柱长一般为15cm、25cm、30cm;50cm一般用于制备柱或特殊柱型,5cm一下为快速柱(包括预柱和保护柱)第5页/共29页色谱柱选择方法 1.氨基酸(1)结构特殊,一般使用离子交换柱分离,阳离子交换柱是使用最广泛,是最成熟的方法。分离氨基酸的阳离子柱分为锂型柱和钠型柱,锂型柱可以分离谷氨酰胺和谷氨酸。(2)反相柱也可以分离氨基酸,但不能分离所有氨基酸。柱前衍生化法分离水解氨基酸也非常有效,且方法简便,所用的仪器简单。第6页/共29页氨基酸分析分析条件:色谱柱:Sh
4、im-pak ISC-07/S1504Li(15cm 4.0mm)(Li型磺酸基,氨基酸分析专用柱)流动相:柠檬酸缓冲溶液,梯度洗脱流速:0.3ml/min柱温:55检测器:荧光(Ex.238nm,Em450nm)方法:OPA柱后衍生化法第7页/共29页色谱柱选择方法肽和蛋白质凝胶过滤:根据分子量的大小差别进行分离离子交换:根据分子所带的电荷的差别进行分离反相和疏水色谱:根据分子的疏水性质的差别进行分离亲和色谱:根据复合的相互作用的差别进行分离第8页/共29页蛋白质分析条件:色谱柱:Shim-pak Diol300 (50cm 7.9mm)(二醇基水溶性凝胶柱,蛋白质分析专用柱)流动相:10m
5、M磷酸缓冲液(pH7)和0.1MNaCl流速:1.0ml/min柱温:室温检测器:紫外(280nm)色谱峰:1.谷氨酸脱氢酶 2.乳酸脱氢酶 3.烯醇酶 4.腺苷酸激酶 5.细胞色素C 第9页/共29页蛋白质分析条件:色谱柱:Shim-pak Diol300 (50cm 7.9mm)(消除残留硅醇基C2柱,300A多孔硅胶)流动相:硫酸铵/磷酸缓冲液(pH7)梯度洗脱流速:0.5ml/min柱温:室温检测器:紫外(220nm)色谱峰:1.细胞色素C 2.肌红蛋白 3.核糖核酸酶A 4.铁传递蛋白 5.糜蛋白酶原A第10页/共29页色谱柱选择方法核酸核酸在生命科学领域中占有重要位置,在今后的新药
6、研发领域中同样占有重要位置。核酸可以分为一下三类:腺嘌呤(核酸碱基)腺苷(核苷;核酸碱基糖)腺苷酸(核苷酸;核苷磷酸)腺嘌呤(核酸碱基)和腺苷(核苷;核酸碱基糖)用阳离子交换柱或反相柱进行分离;腺苷酸(核苷酸;核苷磷酸)用阴离子交换柱分离,选择合适的流动相也可以用反相柱进行洗脱;第11页/共29页核酸分析条件:色谱柱:Shim-pak WAX1 (5cm 4.0mm)(叔氨基阴离子交换柱,用于分析核苷酸)流动相:20mM磷酸缓冲液(pH7)480mM磷酸缓冲液(pH6.8)梯度洗脱流速:1.0ml/min柱温:45检测器:紫外(260nm)色谱峰:1.尿苷酸 2.胞苷酸 3.腺苷酸 4.鸟苷酸
7、 5.尿苷二磷酸 6.胞苷二磷酸 7.腺苷二磷酸 8.尿苷三磷酸 9.鸟苷二磷酸 10.胞苷三磷酸 11.腺苷三磷酸 12.鸟苷三磷酸第12页/共29页核酸分析条件:色谱柱:Shim-pak SBCC8 (15cm 2.5mm)(小孔径硅胶键合C8)流动相:20mM磷酸二氢钾缓冲液/甲醇(93/7)流速:0.5ml/min柱温:室温检测器:紫外(260nm)色谱峰:1.胞苷 2.尿苷 3.鸟苷 4.胸苷 5.腺苷第13页/共29页核酸分析条件:色谱柱:ODS柱 (15cm 6.0mm)(经甲烷基化处理的ODS柱)流动相:100mM磷酸缓冲液和 200mM高氯酸钠溶液 梯度洗脱流速:1.5ml/
8、min柱温:50检测器:紫外(260nm)色谱峰:1.未知峰 2.胞嘧啶 3.尿嘧啶 4.鸟嘌呤 5.腺嘌呤 6.胞苷 7.尿苷 8.胸腺激素 9.腺苷 10.鸟苷 11.胸苷第14页/共29页色谱柱选择方法糖的分离糖的种类很多,可分为单糖(木糖,阿拉伯糖;葡萄糖,果糖,半乳糖)、二糖(蔗糖,麦芽糖)、低聚糖和多糖。单糖和二糖可以使用氨基柱分离(分离异构体效果不很好),还可以使用阴离子交换柱分离,缺点是分离时间较长。低聚糖也可以使用氨基柱分离(分离异构体效果不很好),还可以使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离(色谱柱价格较贵,色谱柱不易保存)。多糖使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离。另外还用部分公司
9、生产糖分析专用色谱柱。第15页/共29页糖的分离分析条件:色谱柱:NH2柱 (15cm 6.0mm)(硅胶键合 NH2柱)流动相:乙腈/水(7/3)流速:1.0ml/min柱温:室温检测器:示差折光色谱峰:1.丙三醇 2.木糖 3.果糖 4.葡萄糖 5.蔗糖 6.麦芽糖 7.乳糖第16页/共29页糖的分离分析条件:色谱柱:磺化聚苯乙烯Ca型柱 (30cm 7.9mm)(分离机理为凝胶渗透配位交换)流动相:乙腈/水(7/3)流速:1.0ml/min柱温:室温检测器:示差折光色谱峰:1.丙三醇 2.木糖 3.果糖 4.葡萄糖 5.蔗糖 6.麦芽糖 7.乳糖第17页/共29页色谱柱选择方法维生素的分
10、离维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素水溶性维生素:维生素B,维生素C,维生素H,维生素P,泛酸等脂溶性维生素:维生素A,维生素D,维生素E,维生素K分离方式:和脂溶性维生素均可使用反相洗脱法分离。一些脂溶性维生素可以使用分配色谱法分离第18页/共29页维生素C的分离分析条件:色谱柱:NH2柱 (15cm 6.0mm)(硅胶键合 NH2柱,分配色谱)流动相:乙腈/10mM磷酸缓冲液(pH2.6)(3/1)流速:1.5ml/min柱温:40检测器:紫外(245nm)色谱峰:1.异抗坏血酸 2.抗坏血酸 第19页/共29页维生素E的分离分析条件:色谱柱:SiO2柱 (5cm 4.6mm)(硅胶键合
11、 NH2柱,分配色谱)流动相:正己烷/二恶烷/乙醇(98/2/0.2)流速:2.5ml/min柱温:室温检测器:紫外(295nm)色谱峰:第20页/共29页维生素E的分离分析条件:色谱柱:NH2柱 (15cm 6.0mm)(硅胶键合 NH2柱,分配色谱)流动相:正己烷/异丙醇(25/1)流速:1.5ml/min柱温:40检测器:紫外(297nm)色谱峰:第21页/共29页维生素B族的分离分析条件:色谱柱:ODS柱 (15cm 6.0mm)(硅胶键合 NH2柱,分配色谱)流动相:【100mM硫酸钠(pH2.1)和1.2mM辛烷磺酸钠】/乙腈(9/1)流速:1.2ml/min柱温:40检测器:紫外
12、(210nm)色谱峰:1.烟酸 2.烟酰胺 3.泛酸 4.磷酸核黄素 5.吡哆素 6.咖啡因 7.硫胺素 8.核黄素 第22页/共29页色谱柱选择方法阴阳离子分离阴离子可以使用离子交换柱分离,也可以使用C18分离(离子对色谱法)。第23页/共29页离子交换法分离二价阳离子分析条件:色谱柱:磺化聚苯乙烯磺酸基离子交换柱 (15cm 5.0mm)(离子交换色谱)流动相:0.3M乳酸水溶液流速:1.0ml/min柱温:40检测器:电导色谱峰:第24页/共29页离子对色谱法分离阴离子分析条件:色谱柱:ODS柱 (15cm 6.0mm)(硅胶键合 NH2柱,分配色谱)流动相:0.8mM苯三酸和10mM四
13、丁基氢氧化铵(pH4.6)流速:1.5ml/min柱温:40检测器:紫外(282nm)色谱峰:第25页/共29页色谱柱选择方法非极性化合物和弱极性化合物一般使用ODS均可分离。被测样品在流动相中微溶,如果溶解度大则出峰较快,不溶则不出峰。芳烃一般作为ODS柱的柱效测试样品,以甲醇水作流动相便可得到对称峰型,否则色谱柱有问题。如果非极性化合物和弱极性化合物在ODS上拖尾,四氢呋喃是很好的减尾剂。带有氨基的有机化合物是检验ODS柱是否封端的指示剂(如尿嘧啶)。第26页/共29页色谱柱柱效测定方法分析条件:色谱柱:ODS柱 (15cm 6.0mm)流动相:甲醇/水(3/1)流速:1.0ml/min柱温:40检测器:紫外(254nm)色谱峰:1.尿嘧啶 2.苯 3.萘 4.联苯 第27页/共29页色谱柱选择方法总结1查文献,学习别人的方法2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件3自己积累药物分析的色谱条件,从中寻找规律,尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下,自己摸索色谱条件第28页/共29页感谢您的观看!第29页/共29页
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