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1、第七章第七章 优良菌种的选育优良菌种的选育授课教师:贺立虎理想的工理想的工业发酵菌种酵菌种应符合以下要求:符合以下要求:遗传性状性状稳定;定;生生长速度快,不易被噬菌体等异种微生物速度快,不易被噬菌体等异种微生物污染;染;目目标产物的物的产量尽可能接近理量尽可能接近理论转化率;化率;目目标产物最好能分泌到物最好能分泌到细胞外,以降低胞外,以降低产物抑制并利物抑制并利于分离;于分离;尽可能减少尽可能减少产物物类似物的似物的产量,以提高目量,以提高目标产物的物的产量并利于分离;量并利于分离;培养基成分培养基成分简单、来源广、价格低廉;、来源广、价格低廉;对温度、温度、pH、离子、离子强度、剪切力等
2、度、剪切力等环境因素不敏感;境因素不敏感;对溶氧的要求低,便于培养及降低能耗。溶氧的要求低,便于培养及降低能耗。v菌种菌种选育育,就是利用微生物,就是利用微生物遗传变异的特性,采用各种手段,异的特性,采用各种手段,改改变菌种的菌种的遗传性状,性状,经筛选获得新的适合生得新的适合生产的菌株,以的菌株,以稳定提高抗生素生定提高抗生素生产或得到新的抗生素或得到新的抗生素产品。品。v任何抗生素要不断提高生任何抗生素要不断提高生产水平,菌种水平,菌种选育是一重要手段,育是一重要手段,一些高一些高产菌株在菌株在传代和保藏代和保藏过程中,不可避免地会逐步程中,不可避免地会逐步发生生退化,退化,这也需要通也需
3、要通过菌种菌种选育来复壮菌种育来复壮菌种 v 菌种菌种选育常用的方法有:菌种的自然育常用的方法有:菌种的自然选育、育、诱变育种、菌种育种、菌种的基因重的基因重组。第一节第一节 微生物的遗传和变异微生物的遗传和变异微微生生物物是是研研究究现代代遗传学学和和其其它它许多多主主要要的的生生物物学基本理学基本理论问题中最中最热衷的衷的研究研究研究研究对对象象象象。对微微生生物物遗传规律律的的深深入入研研究究,不不仅促促进了了现现代代代代分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学和和生生生生物物物物工工工工程程程程学学学学的的发展展,而而且且为育育育育种种种种工工工工作作作作提提供供了了丰丰富富的的理理论
4、基基础,促促使使育育种种工工作作从从不不自自觉到到自自觉、从从低低效效到到高高效效、从从随随机机到到定定向向、从近从近缘杂交到交到远缘杂交的方向交的方向发展。展。研究微生物研究微生物遗传学的意学的意义一、一、遗传与与变异的概念异的概念遗传和和变异是生物体的最本异是生物体的最本质的属性之一。的属性之一。遗传(heredity):亲代代生生物物的的性性状状在在子子代代得得到到表表现;亲代代生生物物传递给子子代代一一套套实现与与其其相相同同形形状状的的遗传信信息息。特特点点:具具稳定性。定性。遗传型型(genotype):又又称称基基因因型型,指指某某一一生生物物个个体体所所含含有有的的全全部基因的
5、部基因的总和;和;-是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。遗传型型+环境条件境条件 表型表型表表型型(phenotype):指指生生物物体体所所具具有有的的一一切切外外表表特特征征和和内内在在特特性性的的总和和;-是是一一种种现实存存在在,是是具具一一定定遗传型型的的生物在一定条件下所表生物在一定条件下所表现出的具体性状。出的具体性状。代代谢发育育变异异(variation):生生物物体体在在外外因因或或内内因因的的作作用用下下,遗传物物质的的结构或数量构或数量发生改生改变。变异的特点:异的特点:a.a.在群体中以极低的几率出在群体中以极低的几率出现(一般(一般为1010-6-610
6、10-10-10););b.b.形状形状变化的幅度大;化的幅度大;c.c.变化后形成的新性状是化后形成的新性状是稳定的,可定的,可遗传的。的。遗传与与变异的概念异的概念饰变(modification):指指不不涉涉及及遗传物物质结构构改改变而而只只发生在生在转录、转译水平上的表型水平上的表型变化。特点是:化。特点是:a.几乎整个群体中的每一个个体都几乎整个群体中的每一个个体都发生同生同样的的变化;化;b.性状性状变化的幅度小;化的幅度小;c.因因遗传物物质不不变,故故饰变是是不不遗传的的。引引起起饰变的的因因素素消失后,表型即可恢复。消失后,表型即可恢复。例例如如:粘粘质沙沙雷雷氏氏菌菌:在在
7、25下下培培养养,产生生深深红色色的的灵灵杆杆菌菌素素;在在37下下培培养养,不不产生生色色素素;如如果果重重新新将将温温度降到度降到25,又恢复,又恢复产色素的能力。色素的能力。遗传与与变异的概念异的概念二、二、遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础 1.遗传基因基因 早在早在1865年,年,遗传学的鼻祖孟德学的鼻祖孟德尔用豌豆做用豌豆做遗传学学试验,得出了重要的,得出了重要的遗传学学规律律著名的分离定律和著名的分离定律和自由自由组合定律,揭示了合定律,揭示了遗传的本的本质:性性状状是是由由遗传因因子子决决定定的的,性性状状的的遗传是是由由于于。遗传因子在子代和因子在子代和亲代代间的的传递。孟
8、德孟德尔的的遗传因子后人改称因子后人改称为遗传基因。基因。孟孟德德尔的的分分离离定定律律和和自自由由组合合定定律律,就就是是成成对基基因因在在杂合合状状态中中保保持持相相对独独立立性性,在在形形成成配配子子时,成成对基基因因彼彼此此分分开开,分分离离到到不不同同的的配配子子中中去去,两两种种配配子子数数相相等等,配配子子的的结合合随随机机;两两对或或多多对基基因因形形成成的的配配子子,是自由是自由组合的。合的。2.基因的物基因的物质基基础 孟孟德德尔不不仅发现基基因因是是生生物物体体遗传的的基基本本单位位,并并认定定基基因因是是由由生生殖殖细胞胞来来传递的的。当当细胞胞核核中中的的染染色色体体
9、被被发现以以后后,人人们认识到到基基因因的的传递规律律和和细胞胞分分裂裂时染色体的行染色体的行为是一致的。是一致的。1910年年摩摩尔根根用用果果蝇进行行的的遗传学学实验证实了了基基因因在染色体上,在染色体上,进而把基因和染色体而把基因和染色体联系了起来。系了起来。1928年年格里费斯的的转化化实验证明明了了染染色色体体的的化化学学成成分脱氧核糖核酸分脱氧核糖核酸(DNA)是是遗传物物质。后后来来在在病病毒毒重重建建实验和和噬噬菌菌体体感感染染实验中中又又进一一步步证明明绝大大多多数数生生物物的的遗传物物质都都是是DNA,只只有有一一小小部部分分病病毒毒(包包括括动物物、植植物物病病毒毒和和噬
10、噬菌菌体体)没没有有DNA,它它们的的遗传物物质是核糖核酸是核糖核酸(RNA)。第二节第二节 菌种复壮与自然选育菌种复壮与自然选育 在在微微生生物物的的遗传与与变异异这对矛矛盾盾中中,遗传是是相相对的,而的,而变异是异是绝对的。的。抗生素抗生素产生菌的生菌的变异主要是异主要是负变异,其表异,其表现为:a.产量低,量低,b.产孢子能力减退,子能力减退,c.菌落形菌落形态不不纯,d.存活能力下降,存活能力下降,e.产色素能力改色素能力改变,f.代代谢活活动减慢,减慢,g.抵抗不良抵抗不良环境能力减弱境能力减弱 这些些变异异是是自自然然发生生的的不不定定向向的的、缓慢慢进行行的的,是一个由量是一个由
11、量变到到质变的的过程程 生生产中中把把变异异细胞胞在在群群体体中中尚尚未未占占主主导的的现象称象称为退化退化现象象.把把变异异细胞胞在在群群体体中中已已占占主主导地地位位的的现象称象称为变异异现象象 当当群群体体中中出出现变异异现象象时,则要要把把群群体体中中的的大大量量变异异细胞胞除除掉掉,只只留留下下少少数数优良良细胞胞进行培育,行培育,这种操作叫做种操作叫做自然自然选育育.菌种的复壮菌种的复壮(rejuvenation):使衰退的菌种恢复原来):使衰退的菌种恢复原来优良性状。良性状。狭狭义的复壮的复壮是指在菌种已是指在菌种已发生衰退的情况下,通生衰退的情况下,通过纯种分离和生种分离和生产
12、性能性能测定等方法,从衰退的群体中找出定等方法,从衰退的群体中找出未衰退的个体,以达到恢复未衰退的个体,以达到恢复该菌原有典型性状的措施;菌原有典型性状的措施;广广义的复壮的复壮是指在菌种的生是指在菌种的生产性能未衰退前就有意性能未衰退前就有意识的的经常、常、进行行纯种的分离和生种的分离和生产性能性能测定工作,以期定工作,以期菌种的生菌种的生产性能逐步提高。性能逐步提高。实际上是利用自上是利用自发突突变(正(正变)不断地从生)不断地从生产中中选种种菌种的复壮措施:菌种的复壮措施:纯种分离:种分离:(平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等)。)。通通过寄主体内生寄主体内生长进行复壮(行复壮(
13、如Bacillus huringiensis的复壮);淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体(采用比较激烈的理化条件进行处理,以杀死生命力较差的已衰退个体)。采用有效的菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。纯化分离的方法纯化分离的方法 1.单孢子分离子分离 微生物群体中存在不同类型菌落的组成,并认为是由一些亚种混合组成的。其原因是遗传基因型与环境因素共同作用的结果。因此,不可能得到绝对纯一的菌种。但通过选择可以得到相对纯一的群体。纯种的种的标准准有两条:一是群体中存在的不同菌落类型数量限制在相对低的水平,例如限制在35种类型以下。二是群体中起主导作用的菌型的比例数应占绝对优势,如达到90以上,或更高
14、的比例,如98、99以上。菌种经群体分离后证明达到以上两条标准即可认为是获得了纯株。v 任何一种微生物群体中都有占主要比例的菌落类型。这一主要类型的生理生化性状,包括产量的高低,便大体上决定了该菌株的特性。v 以“纯种”这一目标选育菌种,主要应该是提高微生物群体中主要菌型的百分比,选择主型菌落在90以上的纯株。同时辅以产量指标的选择。单孢子分离法子分离法:将菌种的分生孢子制成一定浓度的分散的单孢子悬浮液,分离在平板培养基上,挑选单菌落进行筛选。在产量高于亲株的菌株中选择群体中主要菌落类型比例高于90以上的高产量纯株再进行35代连续传代试验,选择传代后生产能力仍保持原来水平范围的菌株,便是高产纯
15、种。2.微微观单孢子分离子分离 用单孢子悬浮液分离单孢子菌落的方法很难保证获得绝对的单孢子菌落。因为在菌落生长过程中缺乏一道检查,检查每个菌落是否由单个孢子生长而成。如果单菌落不是由单个孢子长成,而是由一个以上的孢子甚至孢子团长成,那么就难以保证菌落的纯一。微观单孢子分离可以排除这个弊病,获得真正单个孢子生长形成的单菌落,以利选育得到纯一菌株。微微观单孢子分离的方法子分离的方法:在显微镜下,借助显微操纵器挑取单个发芽孢子,将每个单孢子都单独培养成单菌落。此法可确保单菌落由单个孢子发育形成。排除两个或多个孢子形成单菌落的干扰,为获得纯一菌株打下基础。挑取挑取单孢子的方法子的方法:用直径为2mm的
16、细玻璃捧拉成具有120钝角玻璃丝的挑针,在显微镜下,借助显微镜操纵器,挑取单个发芽孢子。挑针的玻璃丝长度要求不超过5mm。不能人工切断,要求拉成不足5mm长,以求针的光滑而不致伤害芽管。单个发芽孢子的制备是用斜面孢子或其它形式的固体孢子先制成单孢子悬液,在液体培养基中振荡培养1618h,使孢子发芽,以长成芽管为度。芽管的长度以不超过孢子直径为宜。因为芽管过短,不易上针,芽管过长,则容易缠在挑针上,不易下来.为了使孢子发芽适度,必须使用稀释的液体培养基。培养基浓度不要太大,避免养分过于丰富而控制不住孢子的生长。孢子的发芽培养时必须控制较低的温度。常用的培养温度为1618,目的是延缓孢子的生长发育
17、,控制其发芽使产生适度的芽管。然后用毛细管将发芽适度的单孢子液滴在盖玻片上,在不远处再滴上空白液体培养基。此盖玻片覆盖在特制的玻璃小室上。玻璃小室为高约10mm的玻璃圆环,可使挑针伸入。在显微镜下找到单个的发芽孢子后,将挑针移入该孢子的右侧慢慢上抬。靠挑针进入液体时的振动,发芽的单孢子便吸到挑针上,挑上发芽孢子后,便将挑针慢慢下移,移至空白培养基液滴中放入。当挑针插入液滴时,针上的发芽孢子便借针入液体时的振动而离开挑针进入培养液中。用显微镜检查液滴中是否有移入的发芽孢子,同时检查是否是单个孢子。在确证已挑上单个孢子后,则将剩余的孢子液滴用酒精棉擦去。酒精棉宜小,用大头针裹少许脱脂棉捻紧,蘸上75消毒酒精挤干,轻轻将单孢子液滴擦掉,特别要注意少量棉丝有可能把需要保留的液滴在无意中吸掉。如此将盖玻片置凹球片上,在适宜的温度和湿度下培养,每天观察,待菌丝长满培养液滴时,用灭菌小铲取一小簿片无菌的洋菜固体培养基,置于生长的单孢子菌丝体边。或用毛细管吸取稀的洋菜培养基滴于液滴边。使单孢子发育的菌丝继续生长在洋菜块上。每天观察,待长满洋菜块后,再用灭菌小铲将单孢子菌丝体移种至斜面,继续培养到长成单菌落。每批微观单孢子分离需挑3050个单个孢子,长成单菌落后进行筛选。
限制150内